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玻璃奶DNA回收试剂的研制及工艺优化
关键字:DNA片段回收    www.ebiotrade.com  时间:2005年10月26日15:7    来源:丁香园

试剂及方法:
1.1玻璃奶的配制
1) 将100g硅粉(325目)放在500ml的烧杯中,加入500ml蒸馏水搅拌1h。
2) 沉淀2min后倒入干净的烧杯中除去已经下沉的团块,放置2h。
3) 倾滗去上层清液后回收沉淀部分,这时体积大约为 50-75ml。这步操作必须非常小心,因为下沉部分流动性非常大,用以飘浮起来,可能被一起到掉。所以最好的方法是将上清液到置另一烧杯中,至少初次进行这样的操作是可以这样做。
4) 加入蒸馏水置200ml。
5) 加入200ml浓硝酸(分析纯试剂,大约70%),在通风橱烧至近沸。使用浓硝酸时必须小心,要戴上手套并在通风橱中把开瓶盖。
6) 冷却后转移置离心瓶中,用灭菌重蒸馏水(使用双蒸水并经高压灭菌) 悬浮、离心,共洗涤四次。                
7) 将沉淀悬浮在灭菌蒸馏水中制成50%的糊状物(v/v),分成小份装在密闭的容器中贮藏于4℃,反之水分蒸发。
1.2溶胶液NaI溶液的配制90.8gNaI(Sigma S-8379),1.5gNa2SO3(Sigma-0505),加灭菌蒸馏水至终体积为100ml。4℃存放于暗处或不透明容器中。
1.3洗涤液的配制
 50%乙醇,100mmol/l,NaCL,10mmol/l,Tris-HCL,PH7.5,1mmol/lEDTA。室温存储于密封容器中。1.4玻璃奶试剂盒回收DNA片段的实验室步骤
1.待回收的DNA片段经电泳分离后,从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段,放在15 mL Eppendorf管中。
2.加入3倍体积的溶胶液。室温下放置5分钟或50摄氏度保温3分钟,其间轻摇Eppendorf几次使胶完全溶化。
3.加入10mL 玻璃奶,颠倒均匀,冰浴下放置10分钟。每隔2-3分钟混匀一次。12000rpm离心30秒,吸弃上清。
4. 加250 μL 漂洗液,用加样器吹打漂洗液,轻柔地将玻璃奶悬浮混匀,12000rpm离心30秒,吸弃上清。
5.重复步骤4。吸取完漂洗液后,再离心10秒钟,用TIP头将最后一点漂洗液吸干净。然后,放置于37`C温箱干燥15-20分钟。
6.加适量无菌蒸馏水(常规20μL),混匀,60℃水浴5分钟,12000rpm离心1分钟,回收上清备用。(http://www.ebiotrade.com/)

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