绿色荧光蛋白的特性及其在信号转导中的应用
苑晓玲 从玉文 陈家佩
( 军事医学科学院放射医学研究所 , 北京 100850 )
细胞和分子生物学的最终目标是 , 明确细胞内的各种事件是如何发生的 , 明了细胞内复杂的动态变化的生化机制。绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein ,GFP) 自从克隆、表达之后 , 以其良好的物理特性及荧光特性而成为良好的报告基因和荧光标记分子 , 并在探索生命现象过程中得到了非常广泛的应用。 GFP 作为报告基因 , 可用在活细胞中直接观察蛋白质向细胞器 , 如细胞核、内质网中运动 ; 作为荧光标记分子 , GFP 既具有敏感的标记检测率 , 又没有放射性的危害 ; 最近又发现 GFP 是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子 , 可以跟踪观测第二信使 , 如 Ca 2+ 和 cAMP 水平的起伏变化 , 细胞间隙 pH 值的变化等。
1 . 绿色荧光蛋白的特性
目前已有两个 GFP 有明确的生物特性 , 其一是水母中分离到的 GFP , 其二是海洋珊瑚虫中分离到的 GFP 。 1992 年 ,GFP 作为水母发光蛋白的配对物被分离到 , 作为辅助蛋白的 GFP 在水母中的功能是将其所产生的蓝光转换为绿光 , 这是因为它们之间进行了能量转换的缘故 [1 ] , 在低浓度水母发光蛋白和绿色荧光蛋白溶液中 , 这种能量转换是无法进行的。但是 , 如果同时将水母发光蛋白和绿色荧光蛋白固定在一个表面上 ( 如 DEAE - Sephadex) 或在溶液中使用高浓度绿色荧光蛋白 , 则可以观测到绿光的产生。然而 , 为什么一些绿色荧光蛋白能与某种发光蛋白结合在一起 , 其机制仍不清楚。
水母 GFP 是由 238 氨基酸组成的单体蛋白质 , 分子量约 27 kD ,GFP 荧光的产生主要归功于分子内第 65 、 66 、 67 位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。翻译出的蛋白质折叠环化之后 , 在 O 2 存在下 , 分子内第 67 位甘氨酸的酰胺对第 65 位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第 5 位碳原子咪唑基 , 第 66 位酪氨酸的α 2β键脱氢反应之后 , 导致芳香团与咪唑基结合。这样 , GFP 分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团 , 该过程可以自动催化完成。 GFP 晶体结构显示 , 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构 , 长 420 nm , 宽 240 nm , 由 11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成 , 荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的 , 桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖 , 底部由一个短的垂直片段覆盖 , 对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内 [2 ] 。实验表明 GFP 荧光产生的前提是桶状结构完整性 , 去除 N 端 6 个氨基酸或 C 端 9 个氨基酸 ,GFP 均会失去荧光。这是由于生色团形成的效率较低 , 而且形成过程受外界环境影响较大的缘故 [3 ] 。
两个野生型 GFP 在 395 nm 出现一个最大吸收峰 , 在 470 nm 出现一个小的吸收。 395 nm 处的摩尔吸收值约为 9 500/ cm · mol 。出现两个吸收峰的原因可能是由于存在阴性和中性两个不同化学结构的生色团。正是由于存在两个吸收峰的缘故 , 野生型 GFP 可以被标准的长波紫外 (UV) 源和异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate , FITC) 所激发。 GFP 在 509 nm 处激发光最强 , 在 540 nm 处激发光较之为弱。激发态的寿命为 3. 25 ns , 其产生荧光的量值为 0. 72 ～ 0. 85 , 荧光素染料的荧光量值为 0. 91 。然而 , 天然 GFP 的摩尔吸收值却远低于荧光素 [4 ] 。
许多报道显示 , 天然珊瑚虫 GFP 作为生物学标记物 , 比水母 GFP 有更多的优点 , 具更大的前景。在光吸收方面 , 珊瑚虫 GFP 的消光系数比野生型的水母 GFP 高 5 倍 , 比人源化的红移 ( redshifted) 转变的水母蛋白高 2.5 倍 , 与水母 GFP 相比 , 珊瑚虫 GFP 稳定的 pH 范围更广 , 对有机溶剂、去污剂及蛋白酶的稳定性更高。珊瑚虫 GFP 在各种浓度中 , 均以可解离的同型二聚体形式存在。因此暴露在外的疏水表面较小 , 在细胞内与其他蛋白质相互作用的机会较小 [5 ] 。
2. GFP 在信号转导中的应用
新近研究发现 , 某些突变的 GFP 能够发生荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) [6 ] 。 FRET 是一种从荧光分子的激发状态到临近基态接受分子之间量子力学能量转移的现象。 FRET 发生的前提条件是 , 荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量。如果供应分子和接受分子相互定位在几个纳米之内 , 则非常利于 FRET 的产生。因为 FRET 对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感 ( 在纳米范围内 ) 。两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。由于 FRET 能量转移并非是 100 % 的效率 , 一个实用而有效的检测 FRET 的方法是 , 仅仅激发荧光供应分子 , 然后计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率。比值的变化是一个理想的观测细胞动态变化的指标。因为它消除了 GFP 分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的绝对效率等的影响。利用 FRET 可以作成 GFP 依赖的生物探针 , 现已有研究人员设计大分子或分子配对物来改变 GFP 之间原有生理信号反应的 FRET 。
研究发现可以通过调节 GFP 来改变 FRET 。把一个释放蓝色荧光的 GFP 融合到一个绿色荧光 GFP 突变体上 , 并在它们之间介入一个蛋白酶敏感的间隔子 , 这两个 GFP 恰好可以发生 FRET , 当加入蛋白酶时 , 间隔子被切除 , 两个 GFP 之间的距离发生弥散性改变 , FRET 被完全阻断 [7 ] 。该实验提示我们 , 可以通过偶联 GFP 到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子 , 来动态观测活细胞的生理功能。
在上述实验基础上 , 研究人员开始设计 FRET 依赖的 Ca 2+ 敏感指示剂 , 其设计原理是 , 钙调蛋白 (CaM) 通过肌球蛋白轻链激酶 (MLCK) 结合到 CaM 结合区。蓝色荧光蛋白和绿色荧光蛋白通过 CaM 和 MLCK 区域融合在一起 , 当 Ca 2 + 增多时 , 形成更多的 Ca 2+ - CaM 复合物 , 并从 MLCK 结合到 CaM 结合区域。该实验发现 , 通过改变两个 GFP 之间的距离 , 可以增加 FRET [8 ] 。另有一些研究人员 , 并没有把两个 GFP 融合在一个单一结构中 , 而是把一个 GFP 融合到 CaM 上 , 另一个 GFP 融合到 CaM 结合区域 [8 ] 。结果发现 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 出现分子间异源二聚体 , 两个 GFP 足够接近而产生 FRET 。这个实验提示了一个非常重要的现象 , 即 FRET 不仅可以在分子内发生 , 而且还可以在分子间发生。
最近 , 有学者用 GFP 依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学 , 通过利用带有 GFP 标记的蛋白激酶 A 转染细胞 , 观测有关 cAMP 的动态荧光变化 [9 ] 。通过融合蓝色荧光 GFP 到调节亚单位或融合绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位 , 设计出了 cAMP 传感器。当 cAMP 浓度很低时 , 两个荧光分子距离很近 , 并出现 FRET , 如果增加 cAMP 浓度 , 发生 FRET 的可能性急剧下降。利用该方法 , 可以检测出 cAMP 的动态变化 , 并开创了在整体条件下 , 研究 cAMP 调节信号转导途径的新方法。
GFP 的结构虽然具有高度完整性 , 但是实验中发现 , 在 GFP 中某些确定的位置 , 插入外源基因 , 完全没有丧失其荧光性。当把 CaM 插入黄色荧光 GFP 突变体中 , 得到 Ca 2+ 传感器 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 导致生色团去质子化 , 使荧光强度增加 7 倍。当在黄色荧光 GFP 中插入一个 Zif268 锌指结构 , 可以得到传导 Zn 2+ 的 GFP , 结果发现荧光少量增加 , 为改变前的 1.7 倍 , K d 值约 0. 4mmol [10 ] 。插入外源基因致使 GFP 荧光敏感性增强的现象 , 提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导的新路径。
• 改进 GFP 的应用前景
野生型 GFP 合成后需经一定的折叠过程形成正确构象后才有功能 , 而且在 470 nm 处的荧光强度相对较低。为了改善 GFP 荧光特性 ( 如摩尔吸收值及释放波谱 ) , 对 GFP 进行了突变和重组实验。 Chalfie 等 [11 ] 通过测定大肠杆菌和线虫体内重组 GFP 的荧光光谱发现 , 它和提纯的天然 GFP 光谱完全一致。突变实验发现 , 多数突变导致 GFP 部分或完全丧失荧光活性 , 但某种突变使 GFP 明显地改变激发和释放波谱。例如用 The 替代 Ser 65 [12 ] , 在 490 nm 处出现一个单一激发峰值 , 激发后产生的荧光强度是野生型的 6 倍 , 对光淬灭具有更强的抵抗性 , 并且出现红移现象 , 该突变蛋白质与 FITC 的性质相似 ; 同样 Leu 替代 Phe 64 , 即增加 GFP 的可溶性 , 荧光强度增强 35 倍。 3 个氨基酸同时突变时 ( Phe 99 Ser ,Met 153 Thr ,Val 163 Ala) , 在 360 nm 至 400 nm 之间 , 出现最大激发峰 , 而且增大生色团形成的机率 , 可溶性更强 , 荧光强度为野生型 GFP 的 18 倍。现有人认为 , 低浓度 GC 含量是 GFP 低表达的原因之一 , 为此 , 研究人员合成了高 GC 含量的特殊 GFP , 并且发现这种 GFP 有更强的荧光强度 [12 ] 。此外 , 用人蛋白质中偏爱的密码子替代相应的野生型 GFP 中密码子可提高 GFP 在哺乳动物中的表达效率。许多 GFP 突变蛋白 , 不仅改变了激发和释放波谱 , 而且提高生色团形成的效率、溶解度、蛋白质表达等 [13 ] 。
不同的突变体给应用提供了更广阔的前景 , 但是也发现某些突变体在生理变化的 pH 值范围内显示了更大的敏感性。研究人员利用一个 pH 敏感的 GFP 突变体检测细胞质、细胞核、高尔基体和线粒体基质中的 pH 值 , 发现在这些区域测量到的数值与以前报道的测量值有非常好的吻合 [14 ] 。 GFP 依赖的 pH 检测子 , 与小分子染料不同 , 这种检测手段不必考虑染料渗透、环境水解等一系列问题 , 且 GFP 具有高度选择定位性 , 适合于所有对于基因转染敏感的细胞。更重要的是 , 这个实验说明利用组织特异性启动子 GFP 检测特定组织 , 通过融合到目的蛋白 , 可以检测特定类型的细胞、细胞器或特定的细胞内区域中的 pH 值。这样开创了检测以前所不能到达部位 pH 值的可能性。
到目前为止 , 荧光蛋白已有非常广泛的应用 , GFP 可应用于转染细胞的确定 , 体内基因表达的测定 , 蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测 , 免疫分析、核酸碱基探针分析 , 以及分子间第二信使钙离子和 cAMP 水平的指示 , 细胞间隙 pH 变化的检测 [4 ] 。另外 ,GFP 也可以和其他蛋白质形成融合蛋白 , 作为基因治疗检测指标 [3 ] 。但是 ,GFP 在应用中还发现有许多问题亟待解决 : (1) 荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难 , (2) 多数生物具有微弱的自发荧光现象 , 并有着类似的激发和发射波长 , 这个荧光背景会影响某些 GFP 的检测 , (3) 实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株 , 可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关。(http://www.ebiotrade.com/)
参考文献
1 . Kendall JM et al . (1998) Trends Biotech .16(5) :216 — 224
2. Cubitt AB et al . (1999), Methods Cell Biol. 58 :19 — 30
3 . Li X et al . (1997) J Biol Chem .272 ( 45) : 28545 — 28549
4 . Tsien RY.(1998) A nnu Rev Biochem 67 :509 — 544
5 . Hanazono Y et al . (1997) Hum Gene Ther 8 ( 11) :1313 — 1319
6. Manuela Z et al . (2000) IUBM L if e 49 :375 — 379
7. Mitra RD et al . (1996) Gene 173 :13 — 17
8. Miyawaki A et al . (1997), Nature 388 (6645) :882 — 887
9 . Zaccolo M et al . ( 2000), Nat Cell Biol 2 (1) :25 — 29
10. Baird GS et al . (1999), Proc Natl Acad Sci USA. 96(20) :11241 — 11246
