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噬菌体展示随机多肽库
关键字:噬菌体展示|随机多肽库    www.ebiotrade.com  时间:2005年11月14日15:34    来源:网络

噬菌体展示随机多肽库技术是以噬菌体展示技术(phage display)为基础的。1985年由Smith[1]首次通过基因工程手段将外源蛋白质与噬菌体的次要外壳蛋白pⅢ形成融合蛋白展示于噬菌体颗粒表面,可保持相对独立的空间构象和生物活性,而不影响重组噬菌体对宿主菌的感染能力。与其他基因表达系统相比较,噬菌体展示技术的最大特点就是它有效地将被展示多肽或蛋白质和基因偶联起来,构成一个实体,因而在得到某种多肽结构的同时也就获得了它的基因。
pⅢ蛋白因其序列中含有SGGG或SGGGG的重复而具有空间结构的灵活性,因此更适于在N端展示目的蛋白而不影响其空间结构。pⅢ位于丝状噬菌体尾端,具有识别和吸附大肠杆菌性菌毛的功能,为解决融合蛋白失去感染能力这一问题,常采用噬菌质粒和辅助噬菌体双基因组系统。噬菌质粒中pⅢ基因与外源基因融合,辅助噬菌体M13KO7中的pⅢ基因为野生型。当噬菌体颗粒组装时,噬菌质粒DNA被优先包装,这时组装好的噬菌体外壳有一拷贝的pⅢ融合蛋白,其余为野生型pⅢ蛋白,称为单价展示。单价展示时噬菌体感染能力不受影响,而且有利于淘选出高亲和力的目的重组噬菌体。
在丝状噬菌体pⅢ 基因一侧插入特定长度的随机寡核苷酸,从而在噬菌体表面展示与pⅢ融合的随机多肽;由于每一个噬菌体呈现一种序列的外源多肽,那么展示特定长度各种不同序列外源多肽的噬菌体集合体就构成一个完整的随机多肽展示库。本实验室利用改建的噬菌体展示载体pCANTAB5G8构建了噬菌体展示随机十五肽库。拟从中淘选靶蛋白的结合多肽。

亲和淘选
表达于噬菌体表面的融合多肽或蛋白质能被特异性的抗体识别。如果将某种抗体包被于固相载体,就可将表达有相应抗原的噬菌体克隆从众多的噬菌体中分离纯化出来,且抗原的氨基酸序列又可以通过对噬菌体重组体的DNA测序而获得。按照同样原理,可以分离到蛋白质特异结合的配体。随机多肽展示库的出现充分利用了噬菌体展示技术的特点和优势,以生物合成肽库来实现化学合成肽库的功能和用途,并且更加经济和便利。近10年来,大量的研究小组利用噬菌体展示随机多肽库技术构建了不同种类的噬菌体展示多肽库,并从中筛选到不同靶物质结合的多肽,使该技术在多个研究领域得到广泛应用。
噬菌体展示随机肽库的筛选是一个亲和纯化(affinity purification)的生物淘选(biopanning)过程。其具体过程是:先将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间,接着洗涤除去非特异结合噬菌体,将特异性结合噬菌体洗脱下来扩增,然后再投入下一轮的淘选。继续重复淘选、洗脱、扩增,最终淘选出特异结合的重组噬菌体克隆。

凝血酶结合肽
 凝血酶(thrombin,IIα)是一种生成于损伤处血管内皮细胞的多功能丝氨酸蛋白酶,它能水解血纤维蛋白原的4个Arg-Gly肽键,产生不溶性的纤维蛋白,使血液变成凝胶而发生凝固。凝血酶不仅在凝血瀑布反应中起着关键酶的作用,还可能诱发炎症、增生及修复等反应,而且能够和包括神经细胞在内的多种细胞发生反应,并影响其行为。凝血酶如此广泛的生理效应大部分由凝血酶受体介导。
本实验以凝血酶为靶蛋白,从噬菌体展示随机十五肽库中淘选与凝血酶特异结合的多肽。在理论上可以通过对凝血酶结合多肽的序列性质分析来研究凝血酶受体的可能性质;在应用上通过对凝血酶结合肽的研究可以期望进一步找出有效的抗血栓药,具有一定的实际意义。(http://www.ebiotrade.com/)


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