［摘 要］ 蛋白质抗原表位分析在抗原的结构与功能、抗原抗体反应、以及疫苗等新型生物制剂的研究中具有重要意义。近年来，随着噬菌体随机肽库研究技术的发展，人们逐渐将该技术应用于蛋白质抗原表位研究中。结果表明：噬菌体随机肽库技术比传统的蛋白质抗原表位分析技术有着较明显的优点。这种新的蛋白质抗原表位分析技术弥补了传统分析技术的不足，在蛋白质抗原表位分析中具有广阔的应用前景。
蛋白质抗原表位分析是研究抗原分子的结构与功能、抗原抗体反应机制的基础，是研制多肽疫苗，研究新型药物的重要线索和依据。传统的蛋白质抗原表位分析方法主要是通过化学或生物学方法处理抗原分子以获得多肽碎片，再利用单克隆抗体筛选能与之起阳性反应的片段。分析阳性片段的氨基酸序列后合成该序列，并进而确定起关键作用的单个氨基酸。但这种方法存在较多的缺陷，首先是工作量大，工作效率低；其次是成本高；更主要的是，完整蛋白质的抗原表位中，90％是构象型表位，仅10％为线性抗原表位。而合成的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位。这无疑会失去众多的构象型表位信息［1］。近年来的抗原表位研究成果是发现了模拟位（minotope）。模拟位的氨基酸顺序可能与大分子抗原表位的氨基酸顺序截然不同，却可以引起相同特异性的强免疫反应［2］。
80年代末STEPHEN及SMITH研制了一种噬菌体载体系统［3，4］。近年来，利用噬菌体载体系统制备的噬菌体随机肽库逐渐应用于蛋白质的抗原表位分析中。这一新的分析方法弥补了传统分析方法的不足［5，6］。在蛋白质抗原表位分析中具有广阔的应用前景。
1 噬菌体随机肽库的构建
1990年SCOTT将随机序列肽与丝状噬菌体的表面蛋白PⅢ融合，并呈现在噬菌体表面，首次建立了噬菌体随机肽库［7］。噬菌体随机肽库是以噬菌体外壳蛋白PⅢ或PⅧ基因为载体，插入一段编码外源短肽的基因片段。编码外源短肽的简并密码子可指导合成全部20种氨基酸及1个终止子，从而使该肽库包含了该长度短肽的全部或绝大部分可能序列。插入一段外源短肽基因后，噬菌体的浸染能力不受到影响，而外源肽亦可在噬菌体表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空间构象。目前，所构建的肽库短肽长度已由最初的6肽、7肽发展到9肽［8］、15肽［9］，直到38肽［10］、40肽［11］。但在蛋白质抗原表位研究中，并非短肽越长越有使用价值。因为蛋白质的抗原表位通常仅由数个氨基酸组成。
2 噬菌体随机肽库在蛋白质抗原表位研究中的应用
从噬菌体随机肽库中筛选抗原表位的基本原理是生物淘洗（biopanning）。以单克隆抗体筛选蛋白质抗原表位为例，其基本技术流程如下：将单抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌体肽库，使其充分与单抗反应后，洗去未结合的游离噬菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来。将其浸染宿主大肠杆菌扩增后回收，再次与已包被单抗反应进行下一轮筛选。通常经过3、4轮的筛选，并且每次增加筛选强度，这样就可获得与单抗结合较紧密的噬菌体克隆。通过DNA序列分析，就能知道该噬菌体克隆所携带的外源肽序列，从而得知该单抗所针对的抗原表位。
自1990年SCOTT首次将噬菌体随机肽库应用于抗原定位以来，国内外学者进行了大量的相关研究，这些都极大地推动了蛋白质抗原表位的研究进程。
MOTTI利用抗乙肝表面抗原单抗筛选噬菌体随机15肽库，对获得的15肽测序，结果证实其一氨基酸排列与天然抗原极相似［12］。PEREBOEVA利用亲和层析法从两个噬菌体随机肽库中筛选到丙型肝炎病毒的核心蛋白、NS3及NS4蛋白的多个抗原表位［13］。CHIRINOS从噬菌体随机15肽库中筛选到了4个TNF的拮抗体。虽然这4个肽的序列与50 kd和75 kd的TNF受体细胞外表位无相似之处，但仍能抑制TNF的细胞毒作用［14］。KROOK经多轮筛选，在随机噬菌体环10肽肽库中选出了一个与α-糜蛋白酶有较强结合的环10肽。该环10肽能抑制α-糜蛋白酶的活性［15］。COOK利用抗Ⅱ型胶原蛋白单抗筛选噬菌体随机10肽库，经3轮筛选，获得7个克隆，这些克隆制备的10肽，具有抑制单抗与Ⅱ型胶原蛋白的结合反应。分析各克隆序列，结果显示与Ⅱ型胶原蛋白抗原表位序列不同，表明为模拟抗原表位［16］。
国内的学者利用噬菌体随机肽库，也进行了一些蛋白质抗原表位研究工作。李全喜等利用抗原识别位点明确的单抗9E10筛选了噬菌体随机8肽库，结果获得了两个克隆，其中一个与原抗原表位序列同源，而另一个则完全不同［17］。这说明抗原表位主要决定于其空间构象，即使其线性序列不同，只要具有对应的空间构象亦能具有相拟的抗原性。这无疑为今后制备疫苗、筛选药物提供了全新的思路。李爱民等利用生物素化抗狂犬病毒单抗9E6筛选噬菌体随机6肽库，结果获得了4个阳性克隆，这些克隆制备出的6肽对狂犬病毒的脑内感染具有一定的阻断作用［18］。这表明利用噬菌体随机肽库，可筛选出能阻断病毒蛋白质抗原表位的活性肽，显示出良好的药用前景。杜勇等利用亲和层析法纯化丙型肝炎病人血清中特异的抗核心蛋白多克隆抗体，以纯化的多克隆抗体筛选噬菌体随机7肽库，成功地获得了丙型肝炎核心蛋白的抗原表位信息［19］。
由于噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增等突出优点，随着制备技术及筛选技术的完善，噬菌体随机肽库在蛋白质的抗原表位研究中，将会起到越来越重要的作用。
［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（39670713）
［作者简介］ 王细文（1964－），男，湖北鄂州市人，主治医师，讲师，博士，主要从事肿瘤免疫学的研究。(http://www.ebiotrade.com/)
［参考文献］
［1］ CASON J． Strategies for mapping and viral B-cell epitopes［J］．J Virol Methols， 1994，49（1）：209－220．
［2］ 朱锡华，吴玉章．对表位生物学研究的认识和体会［J］．上海免疫学杂志，1998，18（1）：1－2．
［3］ STEPHEN FP， HALL F． Antibody-selectable fila-mentous fd phage vectors：affinity purification of target genes［J］．J Gene， 1988，73（4）：305－318．
［4］ SMITH GP． Filamentous fusion phage：novel expression vectors that display coloned antigens on the virion surface［J］． Science， 1985，228（2）：1 315－1 317．
［5］ DENIELS DA， LANE DP．Phage peptide libraries［J］．Methods Enzymol， 1996，9（1）：494－507．
［6］ FOLGORI A，TAFI R，MEOLA A， et al．A general strategy to identify mimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries，and human sera［J］． EMBOJ，1994，13（9）：2 236－2 243．
［7］ SCOTT JK， SMITH GP． Searching for peptide li-gands with an epitope library［J］． Science， 1990，249（1）：386－390．
［8］ DYBWAD A， FORRE O，NATVIG JB， et al． Identification of new B cell epitopes in the sera of rhumatoid arthritis patients using a random nanopeptide phage library［J］． Eur J Immunol， 1993，23（12）：3 189－3 193．
［9］ CONLEY AJ， KESSLER JA， BOOTS LJ， et al． Neutralization of divergent human immunodeficiency virus type 1 variants and primary isolates by IAM-41-2F5，an anti-gp41 human monoclonal antibody［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1994，41（3）：3 348－3 352．
［10］ KAY BK， ADEY NB， HE YS， et al． A M13 phage library displaying random 38-amino-acid peptides as a source of novel sequences with affinity to selected targets［J］． Gene， 1993，128（1）：59－65．
［11］ RAVERA MW， CARMO J． Identification of an allosteric binding site on the transcription factor p53 using a phage-displayed peptide library［J］． Acta Biochim pol，1997，44（4）：839－847．
［12］ MOTTI C， NUZZO M， MEOLA A， et al． Recognition by human sera and immunogenicity of HBsAg mimotopes selected from an M13 phage display library［J］． Gene， 1994，146（2）：191－198．
［13］ PEREBOEVA LA， PEREBOEVA AV， MORRIS GE， et al． Identification of antigenic sites on three hepatitis C virus protiens using phage-displayed peptide libraries［J］． Med Virol， 1998，56（2）：105－111．
［14］ CHIRINOS RCL， STEWARD MW， PARTIDOS CD， et al． A peptide-mimotic antagonist of TNF-alpha-mediated cytotoxicity identified from a phage-displayed random peptide library［J］． J Immunol， 1998，161（10）：5 621－5 626．
［15］ KROOK M， LINDBLADH C．Selection of a cyclic nanopeptide inhibitor to alphachymo-trypsin using phage display peptide library［J］． Mol Divers， 1998，3（3）：149－159．
［16］ COOK AD， DAVIS JM， MYERS MA， et al． Mimotopes identified by phage display for monoclonal antibody c2-1 to type Ⅱ collagen［J］． J Autoimmuno， 1998，11（3）：205－211．
［17］ 李全喜,王 琰，李 竟，等．识别9E10单抗的噬菌体短肽的免疫学特性分析［J］．中华微生物学和免疫学杂志，1997，17（1）：64－67．
［18］ 李爱民，周志江，宋华宾，等．噬菌体肽库的构建及抗狂犬病毒肽的筛选［J］．中国兽医学报，1997，17（6）：575－580．
［19］ 杜 勇，王海涛．应用噬菌体随机肽库研究丙型肝炎病毒核心蛋白B细胞抗原表位［J］．中华微生物学和免疫学杂志，1999，19（1）：4－8
