酵母双杂合系统的改进和发展
秦宝明 罗述金 米志勇 吴乃虎
（中国科学院发育生物学研究所植物发育与分子生物学实验室 北京100080）
摘要
酵母双杂合系统是在1989年由Stanley Fields和Ok-kyu Song等提出并初步建立的[1]，该系统是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。近几年来随着人们对该系统的广泛应用，这一系统得到了不断的完善及改进，同时也衍生出单杂合系统，三杂合系统等一系列相关的技术。这些技术在不同研究领域中的广泛应用有力地推动了蛋白质与DNA，蛋白质与RNA，以及多种蛋白质分子间相互作用的研究。
关键词 酵母 蛋白质间相互作用 双杂合系统 单杂合系统 三杂合系统
1 酵母双杂合系统的基本原理及应用
酵母双杂合系统最初是在人们对酵母转录因子GAL4的认识基础上的。一个完整的酵母转录因子GAL4可分为结构上可以分开的、功能上相互独立的两个结构域：位于N端1 ~ 174位氨基酸区段的DNA结合域（DNA binding domain, DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(Activation domain, DAN-AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS),并与之结合。而AD则是通过同转录机(transcription machinery)中的其它成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录[2]。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在上较为接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。将DNA-BD与已知的诱饵蛋白质X融合，构建出BD-X质粒载体；将AD基因与cDNA文库，基因片段或基因突变体（以Y表示）融合，构建出AD-Y质粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。该酵母菌株含有特定报告基因（如LacZ, HIS3, LEU2等），并已经支队相应转录因子的编码基因，因此本身无报告基因的转录活性。蛋白质X和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达（图1 ），使转化体由于HIS3或LEU2表达而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ表达而在X-Gal存在下显蓝色。通过筛选阳性菌落即可检测已知蛋白间的相互作用、蛋白质二聚体的形成、确定蛋白质相互作用的结构域或重要活性位点，以及从cDNA文库中筛选与已知蛋白质X相互作用的未知蛋白质Y的编码序列等。
图1 双杂合系统。诱饵蛋白质X与DNA结合域BD融合，待筛选蛋白质Y与转录激活域AD融合，蛋白质X与Y的相互作用导致AD与BD空间上的接近，激活下游报告基因的转录。
2 酵母双杂合系统的改进
在酵母双杂合系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，而这种报告基因的表达往往不能十分严谨地加以控制，因此容易产生一些假阳性。James等人于1996年构建了PJ69-4A菌株[3]，内含三种不同的报告基因（ADE2，HIS3和LacZ），分别受三种不同的启动子（Gal2，Gall和Gal7）调控，而这三种不同的启动子都由GAL4激活，该菌株可灵敏地检测出很弱的结合作用，从而显著地消除了假阳性。考虑到某些诱饵蛋白质X或待筛选蛋白质Y在酵母中大量表达时，可能对酵母产生一定的毒性作用，如使酵母体内的信号传导通路阻断，干扰酵母中正常基因的表达调控，抑制酵母细胞的分裂，甚至使酵母细胞在选择培养基因不能生长等，由此使得对某些种类的蛋白质不能在该系统中进行分析。针对这些异源蛋白质对酵母生长的毒性作用，近几年来在双杂合系统中主要的改进是选用更加灵敏的报告基因从而降低这些异源蛋白在酵母中的表达量，减轻这些异源蛋白质在酵母中的毒性，如采用LexA酵母双杂合系统[4]。在该系统中GAL4的BD区段被原核生物的LexA蛋白质编码区所取代，单纯疱疹病毒的88个VP编码区则取代了GAL4的AD区段。
在酵母双杂合系统中，BD-X与AD-Y在酵母细胞核内发生相互作用，表达的融合蛋白需定向到核内来激活报告基因的转录，这就可能限制了大量非核内蛋白质如膜受体蛋白质，细胞外分泌蛋白质等在此系统中的应用。
针对这一问题，Aronheim等人对传统的酵母双杂合系统做了重大的改进，他们将蛋白间相互作用场所从核内转移到酵母细胞膜上进行[5]，构建了Sos恢复系统（Sos Recruitment Sysstem，SRS）（图2 ），酵母细胞的一种温度敏感菌株、ras途径突变体由于缺乏鸟苷酸交换因子（Guanyl Nucleotide Exchange Factor，GEF）cdc25-2，而不能将外来信号传递给膜上的Ras蛋白，致使该酵母突变体在36℃不能存活，如果人为引入正常的GEF（Sos蛋白），并且使得GEF能与Ras蛋白足够接近，则可以弥补这一缺陷。为此，Aronheim等人将GEF蛋白与蛋白质X融合，将蛋白质Y与豆蔻动酰化信号相连，使Y定位于膜上。这样，若X与Y结合，X连同的蛋白（GEF）就会定位于膜上，从而得以靠近膜上的Ras蛋白，激活ras途径，完成Sos过程，在36℃生长。这一系统的提出大大扩展了经典杂合系统的探索领域，而且冲破了许多的局限。当然，SRS中也存在一些技术上的问题，如必须分离出可能造成假阳性的Ras家族成员以及类Cdc25蛋白。但是我们相信，不论怎样SRS将在构思与应用上给当今的酵母双杂合系统带来新的启迪。
图2 Sos恢复系统（SRS）。诱饵蛋白质X与人的一种鸟甘酸交换因子Sos融合。待筛选蛋白质Y定位于细胞膜上。X与Y的相互作用促使Sos作用于细胞膜上的Ras蛋白质，激活ras途径，使细胞生长。
针对同一个问题，Johnson N与Vashavsky[6]构建了泛素专一性蛋白酶系统（Ubiquitin-Specific Proteases System，USPS）（图3 ）。该系统的基本思想是，泛素与蛋白质新形成的复合蛋白会被一种泛素专一性蛋白酶（UBPs）切断，此专一性切割只在泛素正确折叠的前提下发生。他们发现，泛素N-、C-端两部分在分立共表达时仍能正确地折叠，而当N-末端发生错义突变时，这两个片段将不能正确折叠。但是真正令人感兴趣的是，连于N-端及C-端的两已知蛋白若由于发生相互作用而结合时，这一错义突变带来的折叠困难将意外地得到克服。利用这些特性，二人将X蛋白与泛素C端，Y蛋白（未知）与泛素N端（含错义突变）分别融合相连，这里作为报告蛋白的是连在泛素C端的带有血凝素标记的二氢叶酸带原酶。当X与Y特异结合时，导致泛素两片段能够正确折叠形成“正常”的泛素，使UBP切下报告蛋白，再经免疫印迹分析呈阳性，则可以确知X与Y发生的作用。这一系统可以用于解决很多问题，而且可以用于检测蛋白相互作用中的动力学性质。但是由于USPS不得不借助于免疫学分析技术，相对于表型识别显得繁冗。不过我们相信这一不足会很快得到克服。
图3 泛素专一性蛋白酶系统（USPS）。蛋白质X与Y相互作用，使得与之相连的两泛素片段（基中泛素N端片段带有错意突变）结合，并恢复了正常的功能，从而泛素专一性蛋白酶（UBPa）得以切下报告蛋白（Re）。
另外，本身就有转录激活活性的蛋白质，如RNA聚合酶Ⅱ转录激活因子，会直接激活报告基因而不需要两种蛋白质相互作用，导致假阳性产生，因此不能用来作为诱饵蛋白（Bait），为避开这个障碍，Marsolier等人提出了建立在RNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）转录基础上的双杂合系统[7]（图4 ）。诱饵蛋白X与Y蛋白相互作用，致使带有τ138亚基的pol Ⅲ转录激活因TF ⅢC重建成为功能因子，激少报告基因SNR6的表达。该系统的建立对RNA聚合酶Ⅱ的一系列转录因子多聚体的研究提供了一个非常有效的手段。
目前双杂合系统主要还是建立在酵母这一体系之中，更准确地说，以酵母细胞核作为相互作用的反应场所，外源基因的转录，翻译，蛋白产物的修饰，折叠及细胞内定位等过程是在酵母细胞中完成的。众所周知，酵母毕竟还是一种低等的真核生物，它的各种生物学功能，尤其是蛋白质的翻译后修饰如N端糖基化，二硫键形成等的水平还很难与高等真核生物相比拟。因此要进一步研究蛋白质产物的生物学功能，还必须建立高等生物体系中的双杂合系统。在这一方面，近几年来，已初步建立了哺乳动物细胞双杂合系统激活 [8] 。在哺乳动物双杂合系统中，采用单纯疱疹病毒的BP16编码区取代GAL4的AD区段，同时又引入另一个含有氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol acetyltransferanse, CAT)报告基因的表达载体，采用磷酸钙共沉淀法，转化入HeLa细胞中进行培养。该系统成功地验证了小鼠P53蛋白与SV40大T抗原间的蛋白质相互作用。此后不久，Blau等人利用β-半乳糖苷酶构建的了杂合体系成功地在成肌细胞中得到表达，并检测了FRAP与FKBP12两种蛋白质之间的相互作用 [9] 。此外，在酶母双杂合系统的基础上，结合荧光共振能量转换效应（Fluorescence resonance energy transfer, FRET） [10] 和表面胞质团共振分析技术（Surface Plasmon Resonance , SPR） [11] ，也可对酵母双杂合系统的结果加以验证，从而更加准确地探明大分子间相互作用的机理。
3 酵母双杂合系统的发展
近几年来，双杂合系统不断改进，发展出了许多新的技术，对传统的双杂合系统作出了重要补充和扩展，成为蛋白质间相互作用研究中充满活力的一个领域。
基于酵母双杂合系统建立的基础，在1993年发展出了一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系，该体系被称为酵母单杂合系统 [12] （图5-A ）。酵母单杂合系统的构建与双杂合系统相类似，不同之处在于与转录激活域AD相融合的待筛选蛋白质Y直接与DNA结合位点相结合，使AD直接激活启动子下游报告基因的表达。这一过程无需BD-X的参与 ，因而通过对AD-Y文库的筛选可分离出与靶DNA序列直接作用的蛋白质Y。该系统为转录因子的分离鉴定提供了有效的实验手段。
为了研究阻断大分子间特定相互作用的机理，在原有酵母双杂合系统上发展起反式双杂合系统和分裂杂合系统（图5-B，C ）。
Vidal等人 [13] 采用了反式选择性的报告基因URA3。AD和BD的融合蛋白的相互作用可激活URA3，其编码的酶使细胞不能在5-氟乳清酸存在下生长，即表现酵母菌对5-氟乳清酸敏感。相反地，如果融合蛋白的相互作用被阻断，URA3则不表达，酵母菌则表现对5-氟乳清酸的抗性。因此采用反式双杂合系统可以很容易地检出某一蛋白相互作用的另一蛋白质的突变体。可用于反式双杂合系统的标记基因除了URA3以外，还包括CYH2，其表达使酵母对环已亚胺敏感。基于同样原理，Vidal等人还提出了反式单杂合系统，并已成功地用于分离鉴定p53突变体 [14] 。
Shin等人通过分裂杂合系统得到了类似的结果。该系统用大肠杆菌转录抑制了TetR作为报告基因，并在原报告基因HIS3上游引入一TetR产物结合位点即Tet操纵基因。双杂合融合蛋白的相互作用激活TetR，基表达产物结合于Tet操纵基因，抑制了HIS3的表达。
近几年来，以双杂合思想为基础建立起来的三杂合系统可用业研究多至碱个分子间的相互作用，该系统的主要特征是两个融合蛋白空间的接近通过第三个分子的参与而实现。根据第三个参与对象的不同，可以简单地将其分为蛋白 - 、多肽 - 、激酶 - 、小配体 - 以及 RNA- 等不同的三杂合系统。
蛋白三杂合系统（图6-A ）是指，蛋白 X 与 Y 的相互作用是以蛋白 Z 介导的。蛋白 Z 的作用或是与 X 、 Y 简单地形成三联体，或是诱导 X 或 Y 的构象改变，促进二者结合，进而激活报告基因的表达。 Zhang 与 Lauter 二人在发现 Grb2 可以介导表皮生长因子胞质结构域与 Sos 蛋白的相互作用之后，又进一步阐明可以用这一系统从 cDNA 文库中筛选类 Grb2 基因。
图 5 酵母双杂合系统的改进。（ A ）单杂合系统。待筛选蛋白质 Y 与转录激活域 AD 融合， Y 直接与上游激活域 UAS 结合，导致 AD 激活报告基因转录。（ B ）反式双杂合系统。蛋白质 X 与 Y 的相互作用导致了报告基因 URA3 或 CYH2 转录激活。 URA3 表达使酵母对 5- 氟乳清酸敏感； CYH2 则导致对环已亚胺敏感。阻断 X 与 Y 的相互作用，导致 URA3 或 CYH2 不表达，使酵母在 5- 氟乳清酸或环已亚胺存在下可生长。（ C ）分裂双杂合系统。该系统利用了 E.coli 中 Tn10 编码的 tet 阻遏物（ TetR ） / 操纵基因系统。 X 与 Y 相互作用，抑制 HIS3 的表达，使酵母在组氨酸缺陷培养基上不生长。由于 Y 的突变或解离物 D （ Kissociator ）的引入，阻断了 X 与 Y 的相互作用， TetR 不表达， HIS3 得以正常转录，酵母正组氨酸缺陷培养基上可以生长。
在研究跨膜受体胞外结构域的过程中，发展出了以多肽为配体的三杂合系统。跨膜受体的胞外结构域务自与 GAL4BD 和 AD 融合（形成 X-BD 和 X-AD ）。胞内自身表达的多肽特异性地与受体结合，导致其二聚体化（ X-X ），促使 BD 与 AD 接近，激活报告基因。 OzeubergerBA 与 Young KH （ 1995 ）两个在研究中阐明了生长激素受体及血管内皮生长因子受体 flk1/KDR 的作用机理。这个系统可以用来筛选某些随机肽库，也呆用以寻找在信号传导过程中的作用蛋白及相互作用机理。
关键氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）的磷酸化常常是某些蛋白质加工成熟的重要一步，基于这种研究目的， Osborne 等人 [18] 在原有双杂合系统中加入一可将目的氨基酸残基磷酸化的酪氨激酶 Lck ，只有当蛋白质 X ， Y 中同种被磷酸化后，两种融合蛋白才能够彼此结合（图 6-B ）。应用此方法研究在酪氨酸酶 Lck 存在下， IgE 高亲和性受体的γ亚基（ Fc ε RI γ）与一种新的蛋白质的相互作用。 Lck 使该蛋白质的 SH2 结构域（ Src 同源域 2 ）磷化， SH2 构象发生变化从而得以与 Fc ε RI γ相结合，并激活报告基因的表达。
小配体三杂合系统（图 6-C ） [19] 以小有机化合物共价连接形成的异源二聚体为配体，体现了“二聚化化合诱导物”（ Chemical inducers of dimerization, CIDs ）的概念。 Licitra EJ 与 Jiu JO 利用地塞米松（ Dexamethasone ）与一小鼠糖皮质激素受体（与 LexA BD 融合），以及 FK506 与其受体 FKBP12 （与 AD 融合）的相互作用，构建了第三个杂合配体即地塞米松 -FK506 ，同亲也能激活报告基因。他们利用杂合配基从 cDNA 文库中重新得到了 FKBP12 的 cDNA 。这一系统将 CIDs 与双杂合系统合并使用，在技术上是一个创新，但是，如何使杂合配体顺利扩散进入酵母细胞中仍然是限制其应用的一个重要因素。
1996 年， Putz 等人将杂合系统扩展到了 RNA 领域（图6-D ） [20] 。他们将 HIV-1 的 RevM10 突变体蛋白与 GAL4BD 融合，并者与其靶 RNA 即 Rev 应答元件（ Rev responsive element, RRE ）结合很紧紧。他们又构建一 RRE 杂合 RNA 文库，即 RRE RNA 与蓁种类 RNA 相连接产生的杂合 RNA 文库，从而在 AD-Y 中筛选出与这些种类 RNA 相结合的 RNA 结合蛋白质，根据已知蛋白质也可寻找与这种蛋白质相互作用的 RNA 。 SeuGupta 等 [21] 、 Martin f 等 [22] 等人的成功范例预示着有关 RNA 结合蛋白的研究将会更加深入下去。
4 蛋白质相互作用图谱的构建
随着基因组研究计划的开展，以及 mRNA 在不同组织器官不同发育阶段的表达图谱的构建（ Body map ），蛋白在不同时空状态下相互作用图谱的构建也逐渐展开。近来双杂合系统最引人注目的应用是酵母蛋白质相互作用的横向研究，以揭示多种细胞活动过程中各控制因子间的联系，并进一步探明至今还不了了解或了解很少的大约 3600 种酵母编码基固执功能。目前已经成功地完成一些小规模的蛋白质相互作用图谱，如 T7 噬菌休（ 55 种蛋白质） [23] 和部分真核细胞蛋白亚基等。但是若要对酵母中总共约 6000 种蛋白质进行系统而可信的研究，在筛选方式的自动化程度，数据的精确性，质量的可靠性等方面还需要技术上的进一步提高。
Fromont-Racine 等人 [24] 应用迭代的方式从高质量的基因组文库中不断筛选出相互关联的一系列诱饵蛋白质。在以前的双杂合系统中将两种重组质粒都转化到同一细胞内，这样所得到的可合理检测到的结果较少。 Fromont-Racine 等采用了相互作用接合技术（ Interaction mating strategy ），将 BD- 诱饵蛋白质（ X ）与 AD- 基因组文库（ Y ）分别转化至两种不同交配型单倍体酵母菌株中，令二者在滤膜上接合，然后涂布于选择培养基上，抵消选出阳性克隆作为诱饵蛋白质进入第二轮筛选（图 7 ）。此方法免除了利用二倍体菌株表达时筛选过程中繁琐的交叉影印以及大量培养皿的使用，并能显著地提高相互作用的效率。
图 6 酵母三杂合系统。（ A ）蛋白质和多肽三杂合系统。蛋白质 X 和 Y 的相互作用由蛋白质或多肽配体 Z 介导，形成一稳定的复合体。 Z 可以诱导 X 或 Y 构象改变，促进二者结合，或是诱导受体的胞外结构域二聚体化。（ B ）激酶三杂合系统。酪氨酸激酶（ PTK ）的作用使酪氨酸（ T ）磷酸化（ P ），进而导致相互作用的一方 X 发生构象改变。（ C ）小配体三杂合系统。利用二聚化化合诱导物（ CIDS ）研究受体与有机小配体间的作用。有机小配体是一杂合体；一部分可识别结合蛋白质，另一部分可以是用来筛选其受体的已知小配体，或是对受体进行突变分析；也可以是用来筛选已知 Y 受体的配体的配体文库。（ D ） RNA 三杂合系统。两种杂合蛋白质与一种杂合 RNA 参与相互作用。与（ C ）类似，杂合 RNA 的一部分是已知 RNA ，与蛋白质 X 相互作用，另一部分可用来分析或筛选 RNA 或 RNA 结合蛋白质 Y 。
图7 Fromont-Racine等人采用迭代的方式从基因组文库中不断筛选出相互关联的系列诱饵蛋白质。
图 8 Fields 等人采用的方法。用表达 6000 种 ORF BD 融合蛋白质的每一种酵母菌株重复整个操作，使得 36,000,000 种组合全部得以检验。
Fieldst 等人则利用了酵母中已知的约 6000 种蛋白质编码序列。将每一种序列的可读框（ Open Reading Frames, ORFs ）与 BD 融合在酵母菌株中表达，然后与排列有序的待检测异性菌株交配，后乾表达完整的一系列 AD 杂合蛋白质 [25] （图 8 ）。此过程已实现自动化，并且不需要大规模测序和特异性控制，因此可望成为构建更大的蛋白质相互作用图谱如人类基因组蛋白质的雏形。但其缺陷是利用全长 ORF 的融合，由于毒性，错误折叠以及立体构象等因素可能致使应有的相互作用缺失，这样导致的结果不完整性有多磊尚待进一步研究。
5 结论
自从双杂合系统提出至今八年多来，分子生物学家们不懈的努力终于使得大分子间相互作用研究从过去有限的生化，免疫学技术发展到现在初具规模的各种杂合技术，SPR技术更使得相互作用的动力学研究从技术上有了空前的突破。哺乳动物双杂合系统的应用可较好地解决蛋白质翻译后修饰的问题，不过此技术的缺陷是不能大量筛选转化体，因此今后的一项重要工作还将是把杂合系统更完善的推广到比酵母菌更高等的真核生物体内，以使蛋白质的加工，修饰及相互作用过程更接近于真实状态。另外，构建酶母蛋白质相互作用图谱，利用酵母中与人类相类似的基因进行有关病理学的分子生物学研究等工作也正在生机勃勃地进行着，这些问题的解决必将为揭示细胞生命活动的规律奠定重要的基础。(http://www.ebiotrade.com/)
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