甲基化酶可以用来改变内切酶的识别特异性（1）。由于这种特异性的改变具有专一性，因而拓展了科研人员对酶切序列的选择余地。在体外可以采用与内切酶识别位点重叠的甲基化酶对特异序列进行甲基化，从而导致这些酶不能切开相应的特异序列。

甲基化酶的重叠有两种方式：一种是内切酶识别一系列的序列，而甲基化酶识别其中一个序列。例如，Hinc II识别GTPyPuAC，其中包括四个序列：GTCGAC, GTCAAC, GTTGAC和GTTAAC。而M.Taq I甲基化酶在TCGA的腺嘌呤上进行甲基化。因此，GTCGAC虽然是Hinc II识别的序列之一，但也包含M.Taq I的识别序列TCGA，当底物被甲基化后，Hinc II的其他识别序列还可以被切割，而甲基化后的GTCGAC序列将不再能被切割。HincII的能被切割的识别特异性也可因此改为GTPyAAC。第二类重叠则是指甲基化酶的识别序列与内切酶的识别序列部分重叠。例如，BamH I识别GGATCC序列，如果其后紧跟GG(或在前面紧临CC)，则会产生一个M.Msp I的识别位点(CCGG)。M.Msp I会在其识别位点的5'C端进行甲基化（mCCGG）,则原来BamH I的识别序列内部就因此出现了一个甲基化位点（GGATmCCGG），因而BamH I就不能再切割该位点。

已知的内切酶中，能产生大片段的DNA分子的内切酶数量不多（识别序列要足够长），因此可以采用分步进行保护/切割反应的方法产生较少的切割位点。一个典型的方法是：用M.FnuD II对底物分子进行甲基化（mCGCG），然后再用 Not I（GCGGCCGC）进行切割。这样在Not I/M.FnuD II重叠的位点CGCGGCCGC(或GCGGCCGCG)就无法进行切割。因此在Not I识别位点的前面有一个C或后面有一个G时，Not I就无法进行切割。由此Not I 的切割频率会降低为原来的1/2（1）。

NEB还提供另外一种可改变内切酶表观识别位点的产品-CpG甲基化酶 （M.Sss I, NEB #M0266）。CpG甲基化酶对5'…CG…3'中的胞嘧啶进行甲基化，可用于改变识别序列与之重叠的内切酶的切割特异性。

反应条件：
体外改变表观识别位点分两个步骤：先对特异位点进行甲基化，然后用限制性内切酶进行切割。来自于细菌II型限制/修饰系统的甲基化酶其反应条件与内切酶的相似，只不过还需要S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基来源。因此在进行甲基化反应时可以采用标准内切酶反应缓冲液再加上适量的SAM即可。注意甲基化酶并不要求二价阳离子的存在，而几乎所有的DNA酶（限制性内切酶、外切酶、非限制性内切酶）都需要二价阳离子(Mg⁺⁺)的存在。

切割产物：
体外甲基化的DNA片段在绝大部分方面都和未甲基化的DNA类似。我们也没有发现甲基化的DNA片段在连接上有任何困难。但被胞嘧啶甲基化酶甲基化的DNA在两个方面有所不同：当用Maxam & Gilbert化学法(2)进行测序时，5-甲基胞嘧啶并不出现与正常的胞嘧啶一样的条带。但这并不能造成太大的影响，因为此现象我们能够通过对甲基化酶识别序列的分析进行预测。更严重的问题是当将某些胞嘧啶甲基化的DNA转化到常见的E. coli菌株中时，转化效率会明显降低。原因可能来自于E. coli自身的限制系统：mcrA (rglA)限制Hpa II甲基化DNA (3)，而mcrBC (rglB)则限制Hae III, Alu I, Hha I和 Msp I甲基化的DNA（3）。转化效率低的问题可以通过采用缺失Mcr系统的E. coli菌株进行转化的方法解决。(http://www.ebiotrade.com/)

参考文献：
1.Qiang, B-q. et al. (1990) Gene 88, 101-105.
2.Maxam, A.M. and Gilbert, W. Methods in Enzymology 65, p. 499.
3.Raleigh, E.A. and Wilson, G (1986) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83, 9070-9074.