通过标记的二抗增强信号
如果所制备的标记一抗是不实用的，或者无法提供足够的灵敏度，那就需要高质量的二抗来解决问题。尽管来自于一抗和二抗的非特异性结合可以提高背景水平，选择一个较好的标记了的二抗，通常可以通过显著性的信号扩增来克服升高了的荧光背景。当然，不是每一个商业上可以提供的二抗都是完全被纯化或优化标记的(图3)。Molecular Probes提供了在任何地方均可获得的可以进行最大选择的荧光二抗。（全部目录详见在线手册的第7章，网址是 www.probes.com/handbook）。

图3. Molecular Probes的Alexa Fluor 647山羊抗鼠IgG 抗体与可购买到的其它公司提供的Cy5 山羊抗鼠IgG抗体亮度的比较

这些包括具有强烈荧光的Alexa Fluor抗体耦合物，在各个光谱都胜过大多数常规使用的荧光二抗。在制备每个二抗耦合物时，我们采用了质量最高的蛋白，然后优化标记，以形成最亮的的耦合物，最后使用细胞样品进行严格的测试，以确保低非特异性结合和高特异性染色。
Alexa Fluor二抗正快速成为所有基于荧光免疫测定的首选的二级试剂。在我们新的Image-iT 试剂盒中还将包含几个Alexa Fluor抗体耦合物—－每个Image-iT试剂盒都含一个明亮的并且光稳定的Alexa Fluor耦合物和所有用来优化固定细胞和组织成像的试剂。

通过酪胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification）促使信号增强
当实验样品的靶点不是很丰富的时候，通过二抗的信号扩增是不够的。对于此种情况，我们已经开发了酪胺信号放大技术(TSA)试剂盒(表4)，它利用了超亮度的Alexa Fluor染料以达到最终的高清晰度信号扩增。TSA 技术—有时也称作CARD（catalyzed reporter deposition）—是一种利用了辣根过氧化物酶(HRP)的催化活性在靶蛋白或核酸序列上产生高密度原位标记的酶介导检测方法 (图4)。 据报道，与常规的亲合素-生物素酰化酶复合体（ABC）方法相比，TSA能将信号扩大100倍。在目前可提供的24种Alexa Fluor TSA试剂盒中(表4)，每个耦合于二抗或链霉亲合素上的HRP激活大量的Alexa Fluor tyramide，它可以产生短寿命的，并能与反应位点临近的亲核残基发生强烈反应的tyramide基团，进而产生一个扩散程度最小的放大荧光信号。使用Alexa Fluor TSA试剂盒能够在荧光原位杂交(FISH)、免疫组化、神经解剖学追踪实验、流式细胞仪测定、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、微阵列和其它应用中完成超灵敏的测定。

图4. 图示为应用于抗原免疫标记的TSA检测方法

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对那些既想要容易地使用Zenon 技术提供的HRP，又想用TSA提供的信号扩增技术标记鼠一抗IgG1的研究人员，我们已经开发了两个使用TSA技术改进的Zenon鼠IgG1标记试剂盒－—其中一个含有绿色荧光 Alexa Fluor 488 tyramide，另一个含有桔红色荧光 Alexa Fluor 568 tyramide。这些试剂盒提供了来自于Zenon辣根过氧化物酶鼠IgG1标记试剂盒以及相应的Alexa Fluor TSA试剂盒所必需的试剂，一起的还有详细的进行Zenon复合体形成及tyramide标记的操作流程。更重要的，这种Zenon和TSA技术的结合不受鼠IgG1同种型和Alexa Fluor 488 与 Alexa Fluor 568 tyramides的限制。由于可以得到鼠IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、兔IgG和人IgG Zenon辣根过氧化物酶抗体标记试剂盒，任何具有这些同种型（isotypes）的一抗都能方便地和定量地用HRP来标记，以代替在任何含有这些耦联物的TSA试剂盒中由HRP耦联的二抗。