封闭（1小时），加入生物素标记的探针
洗涤（10分钟），加入Alexa Fluor® 647耦联的链霉亲和素检测（30分钟）
洗涤、干燥和扫描（1小时）
ProtoArray™PPI microarray可以检测新的相互作用以及确证以前检测到的蛋白相互作用。此外，一旦鉴定出阳性的相互作用，就能够很容易地通过使用已鉴定的相互作用蛋白作为探针进行“交互”实验确证这些相互作用。为了证明这一点，两种清楚了解的蛋白钙调素（calmodulin）
和Gsp1p, 用来在ProtoArray™ PPI microarray上进行筛选。从钙调素和Gsp1p二者检测出已知的和新的相互作用（图2）。Panel
A显示了已经了解的钙调素与涉及信号转导的钙调素激酶1（calmodulin kinase 1）以及一种钙调素依赖蛋白激酶（calmodulin-dependent
protein kinase）的相互作用。Panel B 显示已经了解的Gsp1p与一种核蛋白输入所涉及和需要的一种核蛋白Mog1p的相互作用。为了快速验证这些相互作用，使用钙调素激酶和Mog1p作为探针进行“交互”实验。在两种情况下均观察到预期的相互作用；确认钙调素激酶（图2C）结合到钙调素
，Mog1p结合到Gsp1p(图2B)。此外钙调素和Gsp1p也观察到了其它的相互作用，包括许多新的相互作用（表1）。
图4-Quant-iT™ DNA Assay Kit提供灵敏特异的双链DNA定量 |
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使用in vitro biotinylation kit给钙调素和Gsp1p标记生物素并且对Yeast
ProtoArray™ PPI microarray探查。使用Alexa Fluor®
647耦联的链霉亲和素检测相互作用，和使用Axon GenePix 4000B scanner扫描。
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| 探
针 |
已知相互作用蛋白 |
新相互作用蛋白 |
| 钙调素 |
YFR014C (Cmk1p) |
YBR169C (HSP70 family member) |
| YML057W (Cmp2) |
YGL105W (Arc1p) |
| YOL016C (Cmk2p) |
YLR022C (uncharacterized ORF) |
| YJR074W (Mog1p) |
YPL106C (HSP70 family member) |
| Gsp1p |
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YJL184W (ORF, unknown function) |
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YIL108W (hypothetical ORF) |
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鉴定蛋白相互作用常常只是研究的开始，接下来的步骤是要更加精确地了解正在研究的相互作用的生物化学原理，您可以通过检测已鉴定相互作用在广泛的实验条件下的亲和性做到这一点。通过ProtoArray™
PPI microarray，您可以快速而容易地分析蛋白相互作用，使用：
· 使用不同蛋白修饰状态如磷酸化或者糖基化
· 不同的蛋白浓度
· 改变反应条件如离子强度，pH值或者温度
· 添加辅助因子（cofactor）如二价阳离子
这种情况的一个例子是，在加入Ca++或者EGTA后，使用钙调素探查Yeast ProtoArray™
PPI microarray。在存在EGTA时，钙调素：钙调素激酶相互作用被消除，这与已知的这种相互作用的钙依赖性相一致（图3）。使用Yeast
ProtoArray™ PPI microarray，您可以很容易地分析蛋白相互作用的变化反应条件。
图3-钙调素结合相互作用探测条件的影响 |
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使用生物素标记的钙调素在存在Ca++(A)或者EGTA(B)的情况下探查Yeast ProtoArray™
PPI microarray。钙调素激酶（Cmk1）和一种calcineurin类似物（Cmp2）的位置被指示。在出现EGTA时时，这两种蛋白与钙调素的相互作用均消失。（注：增加的点是Alexa
Fluor® 647荧光参照点）。
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由于许多的基本的生物过程在各种有机体之间非常保守，酵母长久以来被作为研究其它真核生物的有用的模型。事实上，50％的酵母蛋白有人类的同源物，包括诸如Ras、组蛋白脱乙酰化酶、细胞分裂调控蛋白、蛋白激酶和钙调素等蛋白。蛋白相互作用在真核生物中常常也是保守的，这一点也不令人感到惊奇。为了证实在研究较高等真核生物蛋白相互作用中使用Yeast
ProtoArray™ PPI microarray的价值，以前实验（图2）检测的钙调素：钙调素激酶相互作用通过使用人的钙调素再次重复。使用人的钙调素也检测到了与钙调素激酶的相互作用（图4）。这就证明了Yeast
ProtoArray™ PPI microarray不仅可以用来在酵母中研究蛋白相互作用，而且也可以作为一个模型，在较高等的真核系统中研究蛋白相互作用。
图4-使用Yeast ProtoArray™ PPI microarray作为人类蛋白相互作用的模型 |
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使用生物素标记的人类钙调素筛选Yeast ProtoArray™ PPI microarray。使用Alexa
Fluor® 647耦联的链霉亲和素检测相互作用。检测到与钙调素激酶（Cmk1p）的阳性相互作用。未标记的点是参照点）。
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确保最大功能
保持微阵列蛋白处于有相互作用功能的状态是在蛋白相互作用分析中使用它们的重要前提。很显然，所有蛋白都保证这一点是不可能的，然而我们已经采取可好几个步骤，尽可能确保蛋白的功能。这些步骤包括精确地控制纯化的条件和方法，专门化的操作和排列微阵列等等。此外选择生产Yeast
ProtoArray™ PPI microarray玻片的表面是由硝化纤维组成，而已知硝化纤维与种类广泛的蛋白功能相兼容（1-4）。为了明确地检验硝化纤维表面与酵母蛋白相互作用的兼容性，鉴定了来自文献的8对双酵母蛋白相互作用对。表达和纯化这些蛋白，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定它们之间的相互作用（表2）。除了一对情况以外（87.5％）所有的在溶液中观察到相互作用的在Yeast
ProtoArray™ PPI microarray上也观察到相互作用。
表2-证明Yeast ProtoArray™ PPI microarray上蛋白的功能
| 酵母蛋白对 |
相互作用分析 |
| 胶迁移（gel
shift） |
Yeast
ProtoArrayTM PPI筛选 |
| YOR117W |
YOR259C |
Yes |
Yes |
| YLR423C |
YDR022C |
Yes |
Yes |
| YMR146C |
YDR429C |
Yes |
Yes |
| YPR181C |
YHR098C |
Yes |
Yes |
| YDL160C |
YCR077C |
Yes |
Yes |
| YOR185C |
YJR074W |
Yes |
Yes |
| YBR109C |
YFR014C |
Yes |
Yes |
| YLR291C |
YGR083C |
Yes |
No |
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文献确定的8对相互作用的蛋白。这些蛋白经过表达、纯化和通过非变性聚丙烯线胺凝胶电泳以及Yeast
ProtoArray™ PPI microarray分析蛋白相互作用。除了1对所有的蛋白对（87.5％）都被两种分析方法检测到。
* 第一栏的酵母蛋白固定在（87.5％）Yeast ProtoArray™ PPI microarray上。第二栏的蛋白用来作为Yeast
ProtoArray™ PPI microarray筛选的探针。
正如前面所述，观察“交互”相互作用的能力充当了另外一次蛋白功能的检验。例如 图2A显示钙调素（探针）与钙调素激酶相互作用。然而，观测到钙调素激酶（探针）结合钙调素依赖于在微阵列上保持正确折叠状态的钙调素（图2C）。同样也可以应用到Mog1p和Gsp1p之间的交互相互作用（图2B和2D）。事实上，在9对蛋白一系列的检验中，8对（∽90%）显示了交互相互作用（表3）。高水平蛋白功能，可以在微阵列上得到大量的蛋白，允许您在蛋白的研究中获得强大的结果。
表3-在酵母微阵列上的交互相互作用
| 酵母蛋白对 |
交互相互作用 |
| YKL166C |
YIL033C |
Yes |
| YOR117W |
YOR259C |
Yes |
| YPL203W |
YIL033C |
Yes |
| YLR423C |
YDR022C |
No |
| YMR146C |
YDR429C |
Yes |
| YPR181C |
YHR098C |
Yes |
| YDL160C |
YCR077C |
Yes |
| YOR185C |
YJR074W |
Yes |
| YBR109C |
YFR014C |
Yes |
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9对酵母蛋白进行蛋白相互作用筛选。首先每对蛋白对中的一个蛋白被选择作为探针筛选Yeast ProtoArray™
PPI microarray。为了进行交互实验，蛋白对的第二个蛋白被用来作为探针。除了一个例外，所有的（88％）使用蛋白对中每一个蛋白均产生了阳性相互作用。
为了便于分析结果，每一个Yeast ProtoArray™ PPI microarray设立了对照。作为检测相互作用的内部对照，每一个酵母蛋白重复印记在微阵列上，此外还有背景、标记和检测对照也被印记到每一个玻片上（图5，表4）。这些对照提供了额外的信息，确保对结果的自信。
图5-Yeast ProtoArray™ PPI microarray对照点 |
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使用anti-GST抗体探查Yeast ProtoArray™ PPI microarray。图中标识了对照点，它们的用途在表4中描述。其它的点来自酵母蛋白。注：所有的点被重复印记。
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大多数蛋白微阵列优良结果的限制因素是产生高质量蛋白的能力。Yeast ProtoArray™ PPI
microarray以耶鲁大学Mike Snyder实验室建立的，来源于酵母收集库的优良的蛋白（5）。这个收集库是由克隆到5’GST融合的酵母表达载体的开放阅读框。通过融合GST标签，蛋白可以很容易地在天然状态下，以高通量的方式快速纯化，增加功能蛋白的可能性。为了在包含在Yeast
ProtoArray™ PPI microarray之前进一步验证收集库，每一个克隆：
· 5’末端测序以测定构建的同一性
· 通过western blot 分析以确定融合蛋白的大小
这就意味着在每一个Yeast ProtoArray™ PPI microarray可能是全长的,蛋白相互作用筛选将产生有价值的结果。
表4对照点提供自信的结果
| 蛋 白 |
分析价值 |
| 只有缓冲液 |
检测与缓冲液的非特异相互作用 |
| BSA梯度 |
蛋白相互作用的阴性对照 |
| Alexa Fluor® 标记抗体 |
确定蛋白在微阵列中的位置的内参照 |
| 抗生物素抗体 |
生物素标记探针的检测 |
| 生物素化抗体 |
检测链霉亲和素耦联的Alexa Fluor® 647 |
| GST蛋白梯度 |
用来蛋白定量和检测GST非特异性结合 |
| 对照相互作用蛋白 |
使用钙调素和钙调素激酶的相互作用的阳性对照 |
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实验之间的可重复性对于成功的研究是非常重要的。Yeast ProtoArray™ PPI microarray的生产是通过整合的数据管理系统、严格的生产和高质量的对照程序进行。生产前，校准仪器和针（pins）以及广泛的质量控制。为了保持蛋白的稳定性和功能，玻片（slides）在6℃的控制的环境条件下被印记。生产后，检测每一个玻片的表面，以发现可能影响实验的明显的不完整。为了控制印记过程的质量，使用anti-GST的抗体标记每一个批号具有代表性的玻片。因为所有的酵母蛋白包含GST
标签，允许很容易地鉴定不规则形态的点和遗漏的点。此外，进行一个分析检测钙调素和钙调素激酶之间的蛋白相互作用，以确保这个微阵列可用于您的实验。
了解每一个点上蛋白的量对于结果的分析非常有用。为了计算每一个点上沉积的蛋白的量，在每一个玻片上点上系列稀释的纯化的GST蛋白（图5）。通过系列稀释的GST蛋白产生的信号可以用来绘制标准曲线，从而可以用来校准每一个点蛋白的量。为了您的方便，提供可以很容易地从我们网站的“在线资源”标号下
www.invitrogen.com/protoarray 下载获取这些信息。这些对照实验以及严格的过程控制和自动化系统意味着您可以预期最大的批号内和批号间的可重复性（图6）。您将在进行的每一次实验中获得一致的质量和重复性。
| 图6-Yeast ProtoArray™
PPI microarray批号内和批号间的重复性 |
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| |
使用Alexa Fluor®
dye检测，易于使用，灵敏度高 |
实验结果的关键是用来检测蛋白相互作用的方法。您可以以少至150μg的纯化蛋白开始，几个步骤之内就可以筛选蛋白相互作用：
1 使用体外生物素标记试剂盒，用生物素标记3个不同浓度的探针蛋白
2 使用包含的生物素标记评估试剂盒，分析哪一个实验浓度产生最佳探查生物素标记
3 使用适合的生物素标记的探针探查Yeast ProtoArray™ PPI microarray
4 接着使用Alexa Fluor® 647耦联的链霉亲和素（streptavidin）检测
5 使微阵列干燥，在任何兼容的微阵列扫描仪上检测
使用Alexa Fluor® 647染料介导意味着高灵敏度、低背景、恒稳定的信号。
一旦您使用Yeast ProtoArray™ PPI microarray完成了实验，可以在几乎任何微阵列扫描仪上检测（表5）和使用标准微阵列分析软件获取数据。分析结果时，您需要蛋白定位和每个点的蛋白定量。为了使您的分析尽可能的容易，登录www.invitrogen.com/protoarry
下载包含这个信息的文件，它可以很容易地输入到您选择的微阵列分析软件中。我们甚至可以提供数据分析指导，以确保您的成功。由于您可以使用您的实验室或者研究室已有的仪器和软件，因而不会有大量资金的支出或者学习使用ProtoArrayTM
要求的曲线。
表5-读取您的结果
| 兼
容 |
Axon GenePix®
4000A |
| Axon GenePix® 4000B |
| Axon GenePix® Professional 4200A |
| PerkinElmer ScanArray™ Lite |
| Tecan LS Series Laser Scanner |
| PerkinElmer ScanArray™ Express |
| PerkinElmer ScanArray™Express
HT |
| 应该兼容 |
AlphaInnotech AlphaArray™ |
| AppliedPrecision® arrayWoRx ®
4-color Biochip Reader |
| Telechem SpotLight® |
| 不兼容 |
Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 |
| Agilent DNA Microarray scanner |
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这些扫描仪已经被检测与Yeast ProtoArray™ PPI microarray兼容。其它扫描仪可能兼容。如果需要兼容与不兼容扫描仪的完整的名单，请登录www.invitrogen.com/protoarry
为了确保您的成功，每个完整的试剂盒包括：
· 两个Yeast ProtoArray™ PPI microarrays允许您在不同的条件下进行2次筛选分析
· 两个对照玻片分析您的探针蛋白在微阵列上的背景和非特异结合
· 生物素化评估试剂盒
· Alexa Fluor® 647检测试剂提供高灵敏度和低背景检测
· 提供探查和洗涤的缓冲，因而不必花费时间配制缓冲液
创新了研究蛋白相互作用的方法。使用Yeast ProtoArray™ PPI microarray，您可以针对酵母蛋白组筛选目的蛋白，在短至4小时内就可以获得结果。您以前从来不能在如此短的时间内做如此多的工作。登录www.invitrogen.com/protoarray，现在就订货。
鉴定每一个筛选的阳性相互作用，证明钙调素激酶与钙调素之间相互作用是阳性（A），Mog1p与Gsp1p之间的相互作用是阳性（B）。然后使用它们进行“交互”实验（分别是C和D）。（注：未标记点是参照点。）
| 产 品 |
包 装 |
目录号 |
| Yeast ProtoArray™ PPI Kitfor
protein-protein interactions with in vitro biotin-labelling |
1 kit |
PA0121011 |
| ProtoArray™ Biotinylation Kit |
1 kit |
AL01 |
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参考文献
1. Espejo, A. et al. (2002) Biochem. J. 367:697-702.
2. Ge, H. (2000) Nucleic Acids Res. 28:e3.
3. Kukar, T. et al. (2002) Anal. Biochem. 306:50-4.
4. Michaud, G.A. et al (2003) Nat. Biotechnol. 21:1509-12.
5. Zhu, H. et al. (2001) Science 293:2101-5.
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