AlphaLISA® Surefire® Ultra™ 细胞磷酸化蛋白检测
打开宽广的激酶探索道路 |
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Alpha SureFire 细胞激酶和细胞信号蛋白检测技术
Alpha SureFire 技术能够快速灵敏地对细胞水平的蛋白质磷酸化作用进行定量检测。它基于成熟可靠的 Alpha 技术，将 Alpha
供体微珠和受体微珠结合在一起，经过一系列化学反应，使细胞内源性蛋白磷酸化信号增强而被检测到。配合细胞转染技术，可以完成高敏感度的各种信号通路、受
体及目标激酶的检测。SureFire 技术可以完成细胞培养及分析物检测“一体化”模式。此方法简化了耗时的分离及洗涤步骤。
SureFire /SureFire Ultra
在传统的AlphaScreen Surefire 检测方法中，用于调控细胞的抗体会与Protein A竞争结合，从而抑制AlphaScreen Surefire(图1) 的信号。新的AlphaLISA Surefire Ultra （图2）采用成熟的CaptSure™技术代替Protein A，不仅实现了试剂盒抗体捕获的特异性，而且具有更低的检测背景。而且新的试剂盒利用AlphaLISA受体微珠代替AlphaScreen受体微珠，对血红蛋白淬灭干扰具有更加出色的抗干扰光谱特性。
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图1 AlphaScreen Surefire |
图2 AlphaLISA Surefire Ultra |
检测特点：
• 细胞样本经过刺激、裂解后只需混合 ，即可检测，无需洗涤
• 检测灵敏度大于等于Western Blot 方法；可以检测过表达及内源水平表达的蛋白；兼容稳定表达细胞系或原代细胞及干细胞
• 无论96、384或1536孔板的检测模式，均可得到很高的Z’值
• 适用于抗体药物的开发使用，适应组织裂解液样品（Surefire Ultra）：
| Surefire Ultra 方法使用新的Captsure标签，有效的避免样品中的干扰抗体与Protein A的非特异性结合（图3）。 而且，
与传统的Surefire检测相比，Surefire
Ultra 也更加适合应用于肝脏这类器官、组织样品的检测。 |
图3由Protein A与抗体药物直接结合而产生信号抑制（假阳性）示意图 |
检测步骤
刺激细胞，
加入lysis buffer
裂解细胞 |
将细胞裂解液与抗体及受体微珠混合，
室温孵育1~2小时 |
加入供体微珠，
室温孵育1~2小时 |
检测 |
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Surefire 与 Surefire Ultra 检测结果对比
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Surefire Ultra与HTRF (Company C) 检测结果对比
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重组磷酸化 ERK的测定。x轴的浓度值与所测样品浓度有关
（对SureFire 而言是 10 μL样品，对 HTRF而言是16μL 样品）
AlphaLISA SureFire Ultra 检测法 (LLOD 0.07 ng/mL) 的灵敏度明显优于标准型与增强型 Company C试剂盒（两种Company C试剂盒的LLOD均为0.63 ng/mL）。 另外，AlphaLISA SureFire Ultra p-ERK 试剂盒的信号窗口分别比高级和标准Company C HTRF p-ERK试剂盒大50 - 100 倍，即前者具有更宽的动态范围。
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与IgG混合后检测结果对比：
EGF刺激A431细胞后，在裂解液中加入
rabbit IgG (10μg/mL),分别用Surefire和Surefire
Ultra磷酸化ERK(T202/204)检测试剂盒检测梯度稀释的细胞裂解液，Surefire试剂盒的检测信号在IgG抗体的影响下有所降低，但是
IgG抗体的加入对Surefire Ultra的检测信号不产生任何影响。 |
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