全球访谈纪要：PacBio RS第三代单分子测序系统

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引言
        第三代单分子测序概念一经提出，就在全球范围内引起了巨大反响，被誉为“未来测序应用的基准线”。
        作为第三代测序技术的代表，也是目前唯一面市的PacBio RS系统，自发售至今走过了最不平凡的25个月。
        期间，几经褒奖，几经质疑。
        有人说，它是“革命性的仪器”，让人类首次领略了单分子合成观测的魅力。
        也有人说，它“门槛太高、应用太窄”，是个奢侈品，无法在常规场合进行推广。
        有人说，它“粗旷而不失细腻”，既能长读长覆盖，又能实时动态记录单碱基信息。
        也有人说，它“眼高手低”，高错误率似乎是个硬伤。
        期间，昔日的同门逐渐淡出江湖。
        Helicos已申请破产保护，Complete Genomics难逃被收购的命运，Oxford Nanopore虽然呼声很高，但宛若空中楼阁迟迟不见现身。唯有PacBio还在奋力前行。
        业界骚动！！不是为了二代测序保住了市场而欢呼，而是为了三代测序的命运坎坷而忧愁，更是为了PacBio的硕果仅存而思考。
        “它到底还能走多远，它到底能走得多好？！”
        问这个问题的人很多，有专家，有媒体，有在用用户，有观望用户，还有大批热衷于新技术的科研粉丝。
        特此收集了PacBio问世以来的一些媒体采访、专家点评、用户心得、官方发言，以主题形式汇编梳理，期望用“原汁原味”的方式，为您呈上2013年的一道“访谈烩菜”。作为谈资也罢，作为解惑也罢，只要您曾经关注过第三代测序，或者正在关注第三代测序。

PacBio公司创始人
Stephen Turner

PacBio公司创始人
Jonas Korlach

■ 主题一：PacBio单分子实时测序技术存在的价值

◆ Broad研究院把PacBio RS系统作为基因分型验证的首选工具
我们分别利用PacBio平台和Illumina MiSeq平台进行对比验证，结果发现PacBio数据有着更好的准确性和假阳性检出率，相对而言是一种更为有效的验证工具。

——Mauricio Carneiro（美国Broad研究院医疗和人口遗传学项目组计算生物学家）
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◆ 如何正确看待错误率和测序数据质量
随机错误是相对比较容易用概率算法进行修正的，但修复系统性误差就不是统计学能够解决的范畴了。……我们开发的算法将PacBio错误率从15%减少为不到千分之一。

——Michael Schatz（美国冷泉港实验室沃森生物科学学院定量生物学助理教授）
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◆ 拥有高质量参考基因组和缺口修复工作的重要性
大量的基因组空白区域中可能存在重要的生物学信息，如果无法补齐Gap，不仅不能获得完整的基因图谱，还会给后续的关键信息解读造成很大的困难。

——Richard Gibbs（美国Baylor医学院人类基因组测序中心总监）
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◆ PacBio在揭示德国大肠杆菌疫情爆发菌株中的突出作用
在此项目证实了PacBio在复杂微生物病原体的de novo测序的能力，以及在多个基因组快速测序上的威力，这些有助于阐明病原体微生物的进化史。

——Eric Schadt（美国西奈山医院基因组学和多尺度生物学研究所总监）
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◆ PacBio RS系统全球用户总评
为了维持基因组学的前沿地位，我们探索基因组测序中的新机会。我们计划使用PacBio来改善病原体的de novo拼接，并提高一些物种的序列信息覆盖度，在未来，我们将通过甲基化位点的直接检测来探索表观遗传学。

——Harold Swerdlow（英国Sanger研究院研发部总监）
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■ 主题二： PacBio RS系统在de novo测序中的优势

◆ 利用PacBio RS系统独立完成微生物de novo完整测序

在羊病微生物基因组de novo测序项目中，我们利用PacBio大于6 Kb的读长数据，只用了20X覆盖度就拼出了1个Contig，而且这一个Contig即是一条染色体。

——Timothy Smith（美国农业部肉类动物研究中心分子遗传学专家）
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◆ PacBio系统结合二代测序技术进行高等基因组的混合拼接

我们研究组先用Illumina数据拼出了Rhodobacter细菌的Scaffold，然后用PacBio的长读长数据去填补Gap。在加入PacBio数据之前，一个Scaffold包含22个Contig，加入PacBio数据后，结果立即改观，拼成了一个巨大的Contig。

——David Jaffe（美国Broad研究院计算研发部总监）
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◆ PacBio系统适用的混合拼接和独立组装软件介绍

我们专门开发了高度自动化的工具PBJelly，能够将PacBio长片段与基因组草图进行比对，填补或减少草图中的缺口，从而完善基因组草图。

——Adam English（美国Baylor医学院人类基因组测序中心生物信息学家）
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■ 主题三： PacBio RS系统首次实现对碱基修饰进行直接测序

◆ 碱基修饰直接测序法的经典案例

你可以通过监测DNA合成得到碱基序列信息，同时，你还额外得到了每个碱基如何掺入的动力学信息。我们用PacBio对E.coli O104:H4菌株进行了“前所未有的全基因组甲基化谱分析”，共发现了50,000多个甲基化位点。

——Matthew Waldor（美国霍华德休斯医学研究所研究员）
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◆ 碱基修饰直接测序法的原理

这就好比是开车经过减速带，一个凸起的路障会干扰车速。每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”产生微小差异，最终反映到荧光脉冲信号的间隔上。

——Stephen Turner（美国PacBio公司创始人兼CTO）
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◆ 直接测序法分析甲基化组学（Methylome）的先行者

通过与PacBio合作完成的全基因组甲基化谱分析，我们可以找到甲基化酶的识别序列，无论是什么甲基化酶，只要它在那。这真是我们首次有能力对细菌基因组进行全方位的甲基化组学分析。

——Richard Roberts（1993年诺贝尔生理学或医学奖得主，现为美国NEB公司CSO）
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◆ 化学标记富集法推动碱基修饰直接测序

我们就是想把5-hmC的检测变得敏感些，最容易想到的是，加个标签以便富集信号。通过这个试剂盒，不光可以检测出羟甲基化修饰，还可以显著降低检测覆盖度。

——Chuan He（美国芝加哥大学生物物理动力学研究院总监）
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◆ 碱基修饰直接测序法适用软件和其他应用案例

目前软件可以自动识别5-mC、4-mC、6-mA等碱基修饰，其它碱基修饰可参照相关文献通过设立对照进行检测。我们还将对软件不断进行升级，2013年陆续推出其他各种碱基修饰类型。

——Edwin Hauw（美国PacBio公司产品管理高级总监）
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■ 主题四： PacBio RS系统在靶向测序和临床诊断中的独到应用

◆ SNP和Indel变异验证、广义单倍体型分析

PacBio单分子测序技术能对基因组中的低频变异进行高效解读，且能够有效弥补Sequenom和Sanger方法的缺陷，可以寻找除已知位点以外的其他漏检稀有突变。

——Matthew Meyerson（美国Broad研究院高级成员）
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◆ 串联重复突变和低频突变检测

我们一开始也不敢确定PacBio是否能应付,但实际使用下来，我们低估了PacBio，在单分子检测条件下，我们竟然能检测到最低至2.7%的突变。

——Neil Shah（美国加州大学旧金山分校医学院血液科副教授）
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◆ 三联核苷酸异常扩增分析

我们证实了PacBio可以测超过750个CGG重复片段，并能够精确定位AGG突变。这种方法保障了单碱基分辨率，今后也能完整鉴定所有与疾病相关的等位基因，从而有利于准确及时的临床诊断。

——Paul Hagerman（美国加州大学戴维斯分校医学院生物化学和分子医学教授）
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◆ mRNA可变剪切和病毒变异分型

而单分子测序则不同，其生成的长片段能一次性完成通读，有助于在大范围内对可变剪切位点进行直接分析。此外PacBio的CCS测序模式能够提供准确度非常高的序列数据，使得转录组可变剪切位点分析更加准确。

——Frederic Bushman（美国宾夕法尼亚大学微生物系教授）
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◆ 临床快速诊断实施和无需建库方案

由于周转时间的限制，PacBio RS系统快速测序能力也是我们选择它的一个主要原因。我们拥有PacBio快一年了，它确实用起来又快又方便。同时，PacBio的序列无偏好性测序的特点也是一个重要考虑因素。

——John McPherson（加拿大安大略癌症研究所基因组技术总监）
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■ 主题五：PacBio的未来方向以及为测序带来的变化？

◆ PacBio系统的已有升级和表现效果

通过最近的软件更新，PacBio RS系统可以产出超长读长并实现超高精度的从头组装，这极大地改善了我们的发现能力，以便更经济高效地获得新型基因组信息。

——J. Craig Venter（全球知名生物学家及企业家，时代杂志2007/2008年将他选进世界上最有影响力的人之一）
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◆ PacBio系统的未来升级方向

理想情况下，单分子边合成边测序反应完全可以做到大规模并行，DNA聚合酶的体外合成效率可以高达1毫秒/碱基。要克服光学技术壁垒，最有前途的方式是把生物现象转化为电信号来检测。

——Madoo Varma（美国Intel公司整合生物系统实验室负责人）
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◆ 总裁展望

我们的客户已经抓住了PiaBio的价值精髓，并开始不惜投入了。正是这些客户将最终成为我们最好的销售向导，而PacBio的独特价值将逐渐引导客户进入下一轮订购潮。

——Michael Hunkapiller（美国PacBio公司主席兼CEO）
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◆ PacBio亚洲代理和测序服务公司

我们非常荣幸能成为PacBio公司在中国大陆和香港的独家经销商，也非常期待能把这一突破性的创新技术带入中国。PacBio RS系统正为我们展开全新的视角，我们同时盼望SMRT 技术能为中国测序界带来前所未有的悸动。

——Cheung To（中国香港Gene Company Limited创始人兼主席）
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近期相关会议推荐
        为全面总结疾病遗传学和基因组学研究进展，探讨后GWAS时代疾病发病机制研究的机遇与挑战，推动转化医学发展，兹定于2013年5月16-18日在上海举行第三届《自然遗传》疾病基因组学国际研讨会（Workshop）。论坛由《Nature Genetics》（《自然遗传》杂志）联合安徽医科大学，上海交通大学和复旦大学共同主办，Myles Axton博士与张学军教授共同任执行主席。论坛主题是“From GWAS to Precision Medicine”，主要围绕复杂疾病的发病调控表达研究，复杂疾病全基因组关联研究meta分析，复杂疾病表观遗传学研究，全基因组外显子测序搜寻疾病遗传变异及转化基因组学研究。
        论坛将邀请来自《自然遗传》、美国哈佛大学、美国华盛顿大学、美国科罗拉多大学、英国伦敦大学、英国邓迪大学、新加坡国立大学，中国医学科学院、上海交通大学、复旦大学、浙江大学、同济大学、中山大学、中南大学及第二军医大学等国内外相关单位权威学者参会。PacBio公司创始人兼首席科技官Stephen Turner先生受邀参会，将在会议期间分享PacBio RS系统特有的单分子实时测序（SMRT）技术在后GWAS时代的创新应用。
        报告题目：Extremely Real Long Reads Using SMRT Sequencing as a Follow Up to Post-GWAS Candidate Regions
        报告人：Stephen Turner, Founder & CTO at Pacific Biosciences
        会议网址：http://www.natureasia.com/en/events/gwas-2013/

1380 Willow Road, Menlo Park, CA 94025
650.521.8000
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