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访谈:做单细胞测序,你真的准备好了吗?听听大咖
怎么说

近几年,单细胞测序是比较热门的研究方向。但是,理想很丰满,现实却很骨感。要做好单细胞测序,还要面临单细胞获取困难、起始量超低、人工操作偏差大的问题。那么如何妥善的解决这些问题,做好单细胞测序呢?为此,生物通特意采访了Takara Bio China NGS团队的产品经理,就客户感兴趣的问题进行探讨。【详细内容
 
小贴士:
Takara Bio是一家以试剂、耗材、仪器和服务为一体的全球知名公司,旨在开发和提供高品质的创新技术和服务,帮助研究人员加速解决在基因检测、调控和功能等领域的问题。旗下的Clontech品牌拥有单细胞RNA-Seq文库构建的核心专利——SMART技术,被誉为单细胞测序行业“金标准”,由此发展出的单细胞全基因组扩增技术、高通量单细胞捕获分选等技术亦在业内享有盛名。



    怎么又多又快的获得想要的单细胞?

获得单细胞有很多方法,常见的有手动挑选、激光显微切割、流式细胞分选等。但这些较为传统的方法,也因为繁琐、通量低、细胞活性差等缺点局限了研究人员对单细胞研究的深入探讨。Takara公司的SMARTer™ ICELL8cx® Single-Cell System能够对几乎所有细胞种类,简单、快速、准确挑选出1800个左右活的单细胞。并可根据不同的研究方向,在该系统上直接实现诸如ATAC-Seq、全长转录组等测序文库的构建,打破了传统方法的局限性。

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    怎么保证超低起始量下获得高品质文库?

「当您做单细胞转录组研究时」


低通量单细胞mRNA分析

NGS技术的出现,使得对RNA的研究变得更为容易,但是对于单细胞进行转录组文库分析,如何获得高质量的全长cDNA一直是很具有挑战性的。Takara公司拥有核心专利SMART技术,在2011年即推出了可以高灵敏度在单细胞水平上分析差异表达、融合基因、可变剪接,并提供全长信息的cDNA制备试剂。而升级的SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing在原有基础上引入LNA技术,提升了模板转换效率,可以检测到比以往更多的基因。

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较高通量单细胞mRNA分析

SMART-Seq HT Kit旨在以较高通量的方式从制备高品质的全长cDNA。通过整合为一步的RT和PCR反应,在4小时内便可快速获得双链cDNA。

单细胞总RNA分析

在单细胞水平,想要满足编码RNA和非编码RNA在内的全部转录组分析,SMART-Seq Stranded Kit是非常不错的选择。它足够灵敏,可以单细胞或微量RNA起始;它足够准确,可以是保留链来源信息;它足够包容,降解样本,也能获得很好的转录组测序文库!

「当您做单细胞全基因组研究时」

单细胞全基因组扩增

针对单细胞中的DNA进行高质量的扩增,Takara公司的PicoPLEX WGA Kit,采用“随机引物引发线性扩增”+“发夹结构”在3小时内,仅需三步即可实现高再现性的全基因组扩增,在全球被IVF行业供应商信赖并用于胚胎植入前遗传学筛查和诊断(PGS/PGD)。

单细胞DNA文库构建

PicoPLEX DNA-Seq Kit这款试剂盒将单细胞全基因组扩增和DNA文库构建两步整合在一起,只需一管三步三小时,便可完成单细胞到全基因组测序文库的华丽变身!

「当您做单细胞免疫组库研究时」

目前,对T细胞受体(TCR)的常用方法是对bulk细胞的TCR CDR3区域进行测序。而采用Takara公司SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit构建TCR文库的优势在于:可以对单个T细胞进行分析,确定T细胞群内特定的alpha-beta 受体链配对信息。这也是以bulk细胞为依托的传统研究手段所无法比拟的。

    怎么减少手动操作所带来的偏差?

对于操作精度要求很高的单细胞层面分析,就算采用了优异的单细胞文库构建试剂,操作也很熟练,但在对多个样本进行同时分析时,难免会因为长时间手动操作所带来的偏差,使得样本间单细胞分析结果的准确性、一致性有所折扣。

Takara公司推出的SMARTer Apollo library prep system introduction,在配套了SMART-Seq v4单细胞cDNA制备Kit后,可高效、可靠、自动化制备多达96个单细胞样品的cDNA用于后续的NGS分析,降低了手动操作时间,减少了实验误差,获得了更准确的结果。
    精彩视频


高通量单细胞全长转录组解决方案

在这次网络研讨会中,Takara Bio USA 公司的Dr. Ankita Das介绍了可以实现较高通量单细胞全长转录组分析的SMART-Seq HT Kit。观看视频



在单细胞水平对人T细胞受体库分析的解决方案

在这次网络研讨会中,Takara Bio USA 公司的Dr. Ankita Das和Dr. Sarah Taylor共同探讨了Takara公司的SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit。这款试剂盒可以利用FACS(流式细胞术)或手动分选的细胞构建 Illumina测序文库。而且,它可以灵敏的捕获并扩增每个细胞中的TCRα和TCRβ链的可变区全长序列,从而提供准确的链配对信息。观看视频



自动化高通量的单细胞水平分析人T细胞受体(TCR)库
在这次网络研讨会中,Takara Bio USA 公司Dr. Sarah Taylor和Thomas Schaal讨论如何在自动化高通量单细胞分选系统SMARTer ICELL8 Single-Cell System上,整合Takara Bio的SMART cDNA合成与RACE文库构建技术分析上千单细胞TCR α链和TCR β链克隆型,以获得TCR多样性数据。观看视频


  文献导读


Cheng, L. et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. J. Clin. Invest. 127, 269–279 (2017).
原文>>

该研究表明,对于正在进行联合抗逆转录病毒治疗期间而IFN-1信号传导持续升高的个体,或许采用阻断IFN-α/β受体可以为增强免疫减少HIV-1储存库提供一种潜在的解决方法。其中,样本是从人源化小鼠脾脏中获得的人CD8T细胞,进一步提取纯化得到的RNA。然后使用SMART-Seq v4 Ultra Low RNA-Seq Kit for Sequencing制备cDNA,之后进行测序。



Sho, S. et al. Digital PCR Improves Mutation Analysis in Pancreas Fine Needle Aspiration Biopsy Specimens. PLoS One 12, e0170897 (2017).
原文>>

本文利用数字PCR(dPCR)分析了胰腺细针抽吸物(FNAs)中KRAS基因的变化,通过单细胞激光显微切割技术鉴定突变检测所需的最小肿瘤细胞数。首先从显微切割的FFPE样本中提取DNA。 使用PicoPLEX WGA Kit进行全基因组扩增,对扩增的DNA进行Sanger测序,以确认从dPCR KRAS突变分析中获得的结果。



Kim, C. et al. Chemoresistance evolution in triple-negative breast cancer delineated by single-cell sequencing. Cell 173, 879–893.e13 (2018). 原文>>

本文着眼于三阴性乳腺癌(TNBC)患者接受新辅助化疗(NAC)过程中,乳腺癌细胞产生化学药物抗性这一现象,结合单细胞DNA和RNA测序探讨其中的机制。取冻存的经过NAC治疗的病人样品,提取细胞核并用SMARTer ICELL8 Single-Cell System高通量分离出单个细胞核。对克隆灭绝患者(clonal extinction)的3,370个单细胞核进行转录组分析。针对4个时间点的样品,每个时间点分选到约500个细胞核,平均各细胞核检测了1.2million reads,检出4107个基因。



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