基于circRNA研究领域顶尖期刊和权威公共数据库，运用强大的信息筛选系统，挑选出可靠的circRNA。
	剪接位点特异性探针与Rnase R预处理双重保障，即便在相应线性RNA存在的情况下也能够特异性检测circRNA。
	数据报告提供circRNA可能结合的miRNA以及对应的host gene和线性RNA，便于从不同角度研究circRNA的作用机制。
	circRNA的特征决定了通过高通量测序的方法检测结果不准确，Arraystar circRNA芯片可以恰到好处地破解这个难题。

circRNA竞争性吸附miRNA

        circRNA序列上含有大量的miRNA结合位点，当circRNA与miRNA同处于细胞浆时会引起circRNA对miRNA的吸附（miRNA sponge）。例如，通过PAR-CLIP实验证实了ciRS-7与miR-7以及RNA诱导沉默复合体（RISC）重要组成成分AGO2蛋白结合；对生物素偶联的miRNA进行pull down实验，进一步验证了ciRS-7吸附miR-7功能的存在。（图1）

图1. ciRS-7序列上含有七十多个miR-7结合位点，它可与miR-7以及AGO2蛋白结合。

circRNA调节RNA结合蛋白（RBP）

        circRNA可以与多种RNA结合蛋白（RBP）作用，进而发挥相应的分子生物学功能（图2）；例如circRNA可以充当RBP的亚细胞转移或定位的载体（图3）、作为RBP的分子海绵，组装RBP复合物以及作为酶活性调节的辅因子等。Antisense类型的circRNA还可以通过碱基互补配对的方式与相应的mRNA结合，进行调控mRNA的稳定性。

	图2. circRNA与RNA结合蛋白（RBP）之间的相互作用
	图3. circRNA在神经元胞体及树突动态分布示意图

circRNA的生物学功能

        miRNA分子调控生物体内1/3左右的基因，circRNA对miRNA的吸附会影响基因的表达，进而引起生物学表型或状态的改变（图4）。相当大一部分环状RNA的靶标基因是介导信号传导的蛋白激酶。研究还表明，circRNA的异常表达往往和临床疾病相关，比如肿瘤、阿尔茨海默症、动脉粥样硬化等。

图4. 斑马鱼胚胎过表达ciRS-7（右图）会导致中脑（MB）缩小，而端脑（TC）大小不受影响。

circRNA的高稳定性

        circRNA分子独特的闭合环状结构，不受核酸外切酶影响，使circRNA的稳定性要远远高于同一个基因转录的相应线性RNA分子（图5）。circRNA的高稳定性预示其非常适用于临床biomarker研究。

图5. circRNA在细胞内稳定性远高于同一个基因转录的相应线性RNA，前者半衰期＞48h（右图），而后者半衰期＜20h（左图）。

circRNA高通量筛选的利器：RNA-seq or microarray？

        circRNA在细胞内含量极低，约占线性RNA的5-10%，通过测序获得的circular junction reads 数目更低。RNA测序仅仅能有效检测低于5% 的circRNAs（图6），即便将测序量提高到300M reads，对于检测准确度的影响也是微乎其微。
        测序不是circRNA高通量筛选的优质检测手段，circRNA-seq需要双端模式和极高的测序量。此外，后续的数据分析（如mapping所需数据库、circRNA转录本组装、特殊生物信息学算法、计算机筛选程序等）也存在一系列难题。由于上述因素所限，通过circRNA-seq发现新的circRNA的可能性几乎为零。
        circRNA芯片采用特异性剪接位点探针与外切酶预处理双重保障，能够准确检测样本中circRNA的表达。芯片杂交不受RNA丰度的影响，即便在一个细胞中只含一个circRNA拷贝也能够做到特异性检测。此外，芯片避免了circRNA-seq复杂的建库过程，其高效成熟的技术是circRNA高通量筛选的优质平台。

图6. 定量可靠的转录本比例与测序深度关系图。RNA测序一般产生低于30M mRNA reads（蓝圈），低于0.5M circular junction reads（红圈），低于5%的circular junction真正得到有效检测。（Adopted from Labaj et al, (2011) Bioinformatics [PMID 21685096].）

国际尖端circRNA研究利器

        Arraystar circRNA芯片是准确检测样本中circRNA含量理想的工具。剪接位点特异性探针与Rnase R预处理双重保障，即便在相应线性RNA存在的情况下也能够做到特异性检测circRNA。数据报告中详尽的circRNA注释信息十分便于客户进行circRNA机制研究。

图7. circRNA芯片实验大体流程（上图）及详细的circRNA注释（下图）： circRNA对应的线性RNA及miRNA的结合位点。

研究技术路线

        通过芯片筛选获得组间差异表达的circRNA，接下来通过低通量circRNA-PCR的验证（图8）锁定目标circRNA分子。目标circRNA分子可以展开不同方向的研究：临床biomarker或功能机制（图9）。

图8. circRNA PCR验证引物设计示意图	图9. circRNA基本研究思路示意图

环状RNA芯片参数

	Human	Mouse	Rat
Total Number of unique circRNAs	13,617	14,236	14,145
Probe Length	60nt	60nt	60nt
Probe Region	Circular junctions of circRNA
Probe Specificity	Transcript-specific
circRNA Enrichment	RNase R treatment
Labeling Method	Labeling by random primers
Circular RNA Sources
Salzman’s circRNAs (2013)	8,529
Memczak’s circRNAs (2013)	1,601	1,750
Zhang’s circRNAs (2013)	93
Zhang’s circRNAs (2014)	4,980
Jeck’s circRNAs (2014)	3,769
Guo’s circRNAs (2014)	5,536	570
You's circRNAs (2015)		13,300	12,298
Mouse circRNA orthologs			1,668
Human circRNA orthologs			179
Array Format	8 * 15K	8 * 15K	8 * 15K

参考文献

[1] Guo, J. U., V. Agarwal, et al. (2014). "Expanded identification and characterization of mammalian circular RNAs." Genome Biol 15(7): 409.
[2] Jeck, W. R., J. A. Sorrentino, et al. (2013). "Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats." RNA 19(2): 141-157.
[3] Memczak, S., M. Jens, et al. (2013). "Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency." Nature 495(7441): 333-338.
[4] Salzman, J., R. E. Chen, et al. (2013). "Cell-type specific features of circular RNA expression." PLoS Genet 9(9): e1003777.
[5] Zhang, X. O., H. B. Wang, et al. (2014). "Complementary sequence-mediated exon circularization." Cell 159(1): 134-147.
[6] Zhang, Y., X. O. Zhang, et al. (2013). "Circular intronic long noncoding RNAs." Mol Cell 51(6): 792-806.
[7] You X. et. al. (2015) “Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulated by development and plasticity.” Nat Neurosci. 
     2015 Apr;18(4):603-10
[8] Hentze and Preiss (2013) “Circular RNAs: splicing's enigma variations.” EMBO J 3;32(7):923-5.

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