载体 |
启动子 |
筛选 |
融合标签 |
蛋白酶切 |
特性与应用 |
N端 |
C端 |
pET-3a-d |
T7 |
Amp |
T7 |
无 |
无 |
pET基本型，可通过选择合适的载体，保证插入片段阅读框正确 |
pET-5a-c |
T7 |
Amp |
T7 |
无 |
无 |
pET-9a-d |
T7 |
Kan |
T7 |
无 |
无 |
pET-11a-d |
T7lac |
Amp |
T7 |
无 |
无 |
pET-17b |
T7 |
Amp |
T7 |
无 |
无 |
pET-17xb |
T7 |
Amp |
T7(260aa) |
无 |
无 |
pET-12a-c |
T7 |
Amp |
ompT |
无 |
SP |
融合表达的信号肽协助目的蛋白转运到细胞周质，促进蛋白正确折叠；转运时信号肽被信号肽酶（SP）切除 |
pET-20b(+) |
T7 |
Amp |
pelB |
His |
SP |
pET-22b(+) |
T7lac |
Amp |
pelB |
His |
SP |
pET-25b(+) |
T7lac |
Amp |
pelB |
HSV/His |
SP |
pET-26b(+) |
T7lac |
Kan |
pelB |
His |
SP |
pET-27b(+) |
T7lac |
Kan |
pelB |
HSV/His |
SP |
pET-14b |
T7 |
Amp |
His |
无 |
Tb |
带有可切除的N端His融合标签的基本载体类型 |
pET-15b |
T7lac |
Amp |
His |
无 |
Tb |
pET-16b |
T7lac |
Amp |
His |
无 |
Xa |
pET-19b |
T7lac |
Amp |
His |
无 |
Ek |
pET-21a-d(+) |
T7lac |
Amp |
T7 |
His |
无 |
N端带有T7融合标签表位，N端或C端带有His融合标签 |
pET-23a-d(+) |
T7 |
Amp |
T7 |
His |
无 |
pET-24a-d(+) |
T7lac |
Kan |
T7 |
His |
无 |
pET-28a-c(+) |
T7lac |
Kan |
His/T7 |
His |
Tb |
pET-29a-c(+) |
T7lac |
Kan |
S |
His |
Tb |
带有可切除的N端S/His融合标签，C端带His标签。可选择不依赖连接反应克隆（LIC）方式 |
pET-30a-c(+) |
T7lac |
Kan |
His/S |
His |
Tb/Ek |
pET-30EK/LIC |
T7lac |
Kan |
His/S |
His |
Tb/Ek |
pET-30Xa/LIC |
T7lac |
Kan |
His/S |
His |
Tb/Xa |
pET-31b(+) |
T7lac |
Amp |
KSI |
His |
无 |
促进形成包涵体，适合表达小肽 |
pET-32a-c(+) |
T7lac |
Amp |
Trx/His/S |
His |
Tb/Ek |
带有可切除的N端Trx标签，促进形成可溶蛋白，C端带His标签。可选择不依赖连接反应克隆（LIC）方式。 |
pET-32EK/LIC |
T7lac |
Amp |
Trx /His/S |
His |
Tb/Ek |
pET-32Xa/LIC |
T7lac |
Amp |
Trx /His/S |
His |
Tb/Xa |
pET-33b(+) |
T7lac |
Kan |
His/PKA/T7 |
His |
Tb |
PKA位点用于32P标记 |
pET-39b(+) |
T7lac |
Kan |
DsbA/His/S |
His |
Sp/Tb/Ek |
带有可切除的Dsb标签，协助蛋白转运到细胞周质，促进蛋白正确折叠 |
pET-40b(+) |
T7lac |
Kan |
DsbC/His/S |
His |
Sp/Tb/Ek |
pET-41b(+) |
T7lac |
Kan |
GST/His/S |
His |
Tb/Ek |
GST标签用于纯化和鉴定蛋白；带有可切除的N端标签，C端带His标签。 |
pET-42b(+) |
T7lac |
Kan |
GST/His/S |
His |
Tb/Xa |
pET-43.1a-c(+) |
T7lac |
Kan |
Nus/His/S |
HSV/His |
Tb/Ek |
带有可切除的Nus标签，显著提高蛋白可溶性 |
pET-44a-c(+) |
T7lac |
Kan |
Nus/His/S |
|
|
pET-45a-c(+) |
T7lac |
Kan |
His |
S |
Ek |
带有可切除的His标签，C端S标签；可选择不依赖连接反应克隆（LIC）方式。提供不同复制子形式载体用于共表达 |
pET-46EK/LIC |
T7 |
Amp |
His |
S |
Ek |
pET-47b(+) |
T7lac |
Kan |
His |
S |
HRV3C |
利用HRV3C蛋白酶在亲和纯化过程中在柱去除融合标签，低温操作，方便快捷，保留更多的蛋白活性 |
pET-48b(+) |
T7lac |
Kan |
Trx/His |
S |
HRV3C |
pET-49b(+) |
T7lac |
Kan |
GST/His |
S |
HRV3C |
pET-50b(+) |
T7lac |
Kan |
His/Nus/His |
S |
HRV3C/Tb |
pET-51b(+) |
T7lac |
Amp |
Strep.Tag II |
His |
Ek |
利用融合标签Strep.Tag II与其相应亲和树脂有高度特异性结合，一步纯化得到纯度高于95％的目的蛋白。 |
pET-51 Ek/LIC |
T7lac |
Amp |
Strep.Tag II |
His |
Ek |
pET-52b(+) |
T7lac |
Amp |
Strep.Tag II |
His |
HRV3C/Tb |
pET-52 3C/LIC |
T7lac |
Amp |
Strep.Tag II |
His |
HRV3C/Tb |
Duet共表达系列
研究大肠杆菌中的共表达有助于获得更多蛋白复合物的知识。实践证明共表达优点很多，包括增加目的蛋白的产量、可溶性、活性并减少降解等。 Novagen的Duet系列新载体也是T7启动子表达，载体间彼此间复制子兼容、抗性不同，可以在一个宿主菌中，根据需要表达多达8个蛋白。选择Duet载体和普通pET或pETcoco™载体组合，也可以进行共表达。详细情况请参阅Novagen 2004-05目录206-209页
Radiance™克隆法
这种PCR克隆方法提供各种大肠杆菌、昆虫和哺乳动物细胞表达载体，共同具有以下优点，使表达变得更加便捷：
- LIC（非连接反应克隆）法确保定向、高效克隆
- 目的基因可以在Radiance系列任何载体间实现方便的亚克隆，便于多系统表达
- 载体均为Ek/LIC式，可以通过肠激酶处理去除所有载体来源的氨基酸序列，实现纯化后获得全天然序列蛋白
- 可以完成多个蛋白同时表达
- 详细情况请参阅Novagen 2004-05目录58-58页
VariFlex™大肠杆菌表达系统
VariFlex™大肠杆菌表达载体同时带有新克隆的增加可溶性的SET（solubility enhancement tag）标签，用于可溶蛋白定量的Q（quantitation）标签以及SBP（streptavidin binding peptide tag）链亲和素结合多肽标签，使真核蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化又有了新的选择。
- 单一载体同时提供增加可溶、定量检测和温和纯化所需的三类标签
- 提供完备的载体选择和配套表达菌株
昆虫细胞表达
Novagen提供3种昆虫细胞表达的分方案：高水平瞬时表达，持续稳定表达以及裂解性杆状病毒系统。
瞬时表达
这一表达策略的关键是保证很高的转染效率。通常转染后24－48小时表达达到高峰。结合Novagen的Insect GeneJuice专用转染试剂，InsectDirect质粒载体能实现高水平瞬时表达。
- 不需要构建重组杆状病毒，而且由于载体的双启动子设计，蛋白的表达和检测可以在昆虫细胞和大肠杆菌中进行。
- 昆虫GeneJuice转染试剂专用于Sf9细胞的高效转染，毒性极低。配套Ni-NTA纯化试剂盒用于纯化His融合蛋白。
- 48小时实现表达，而非通常的2－3周。
- 特别适合用于高通量多目标蛋白表达分析。
- 表达产量高，1 ml培养基目的蛋白可达22 μg。
- 载体种类多，可以根据需要选择带N-端、C-端融合标签的表达，带分泌信号的表达，或不带标签的天然蛋白表达。
InsectDirect与传统杆状病毒方法的比较
|
InsectDirect 系统 |
|
细菌转位法 |
|
传统杆状病毒法 |
第1天 |
以昆虫GeneJuice转染试剂转染pIEx重组质粒进入Sf9细胞 |
第1天 |
以细菌来源的AcNPV重组子转染昆虫细胞 |
第1天 |
以重组转移质粒和线性AcNPV载体DNA共转染昆虫细胞 |
第3天 |
纯化目的产物 |
第4天 |
收获重组杆状病毒；表达检测；扩增制备高滴度病毒 |
第4天 |
选择噬斑并重新铺板 |
|
|
第7天 |
测病毒滴度 |
第8天 |
挑选噬斑并扩增 |
|
|
第11-13天 |
转染昆虫细胞并表达蛋白 |
第11天 |
表达筛查；扩增 |
|
|
第14-16天 |
收获细胞并纯化蛋白 |
第14天 |
测病毒滴度 |
|
|
|
|
第18天 |
转染昆虫细胞并表达蛋白 |
|
|
|
|
第20-21天 |
收获细胞并纯化蛋白 |
持续稳定表达
在糖蛋白、分泌蛋白以及受体膜蛋白的表达研究中，采用稳定转染细胞进行持续表达比较有利。结合pTK-neo载体（带有新霉素等抗性标记的质粒）共转染昆虫细胞，。InsectDirect质粒型表达可以建立多种稳定表达细胞系。多数抗性细胞会以不同水平持续表达目的蛋白。这些细胞系能传代并保持表达（可达50代以上），特别适合积累并对目的蛋白作长期研究。
BacVector杆状病毒表达系统
Novagen的 BacVector系统包括线性杆状病毒DNA，昆虫细胞以及转染试剂，适合最高效、持续的昆虫细胞表达的需要。 |
