一个神奇的FFPE样本建库神器之RNA篇

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian

Formalin Fixed and Paraffin Embedded

        FFPE最早主要是用于病理形态学的观察。随着NGS技术的快速发展,从FFPE样本中分离纯化核酸进行后续的研究逐渐成为重要手段。
        但是,FFPE-RNA测序无疑是“难于上青天”的存在。首先,在FFPE样本处理和储存过程中,很容易发生核酸的降解和损伤,而且RNA相比DNA更易降解。再者,众所周知,完整的RNA分子含量非常有限,总RNA样本中约90%都是核糖体RNA(rRNA)序列,所以从有限且珍贵的材料中获得完整且准确的信息有很大的难度。


所以,

如果恰好做转录组的测序,如果恰好是FFPE来源样本,如果恰好有以上困惑,
那么,这个神器值得拥有

【SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian】

“离经叛道”的rRNA去除模式

        FFPE样本珍贵,担心从总RNA中去除rRNA,会造成纯化后的起始样品太少?选择它吧,不按套路出牌的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian(以下简称SMARTer Pico v2),特别的黑科技Zap R v2& R-Probes核糖体cDNA去除技术,可以实现不需要前处理(去除核糖体RNA)带来不一样的操作体验!

技术概要:

(以上图片来源于Takara Bio Inc.)

“难以置信”的RNA品质包容度

        FFPE样本降解严重,害怕不能得到高质量文库?选择它吧,专为低质量样本设计的,可以FFPE样本中提取的的total RNA起始,6小时内制备具有方向性的文库!完美支持FFPE RNA(DV 200> 25%)获得高品质的文库!

Tips:
        DV 200
指的是一种评价RNA质量的指标,即长度超过200 nt的RNA片段在所有RNA序列中的比例。RNA的质量越高,DV200值越高。

        Takara分别测试了DV200在28%-68%之间的4个FFPE RNA样本,以10 ng起始使用SMARTer Pico v2试剂盒进行文库构建。通过对样本的评估发现,无论RNA质量如何,都可以生成高质量的文库,且基本都无接头二聚体的扩增产物产生。即使DV200低于30%(RNA样本高度降解),也能表现出较高的文库得率!
(以上数据来源于Takara Bio Inc.)

“事实说话”-用户实例分享

        听了这么多,还是担心是“王婆卖瓜,自卖自夸“。选择它吧,相信我,用事实说话的,不仅仅有某著名访谈,还有SMARTer Pico v2!不仅仅有Takara严谨的数据评测,还有实力用户的真实反馈加持!

臻和(北京)科技有限公司的研发团队:
        取3个不同降解程度的FFPE-RNA样本---A,B和C样本(DV200在11%-80%之间), 使用SMARTer Pico v2试剂盒制备文库,然后进行NGS分析。其中B样本分别以10 ng和50 ng起始,其他A、C样本均以50 ng起始。

        从结果可以看出,不论FFPE-RNA的品质和起始量的高低如何,都有相当高的转录本检测数(当FPKM1时,转录本数均大于10,000),而且不同样本之间的一致性也非常高!其中同一样本(B样本)的不同起始量之间,即使是特别低的10 ng起始量,也显示出与50 ng起始量高度一致的数据结果!同时值得注意的是,C样本(DV200=11%,RIN=2.5)虽然高度降解,质量较差,但转录本检测数、Q20和Q30等关键性指标仍然非常出色!

        这些数据都佐证了以降解样本起始时,使用该试剂盒可以得到高品质的文库!

Input amount A(50ng) B(50ng) B(10ng) C(50ng)
DV200(%) 75 80 80 11
RIN 7.5 2.1 2.1 2.5
Total reads 54,354,978 60,432,366 58,448,242 50,730,574
% duplicates 32.9 24.6 34 18.8
transcripts≥ 1 FPKM 11,510 11,698 11,730 10,450
transcripts≥ 0.1 FPKM 20,559 19,531 19,439 22,486
Q20(%) 97.54% 97.55% 97.56% 95.08%
Q30(%) 94.13% 93.92% 93.98% 90.66%
以上数据由臻和(北京)科技有限公司提供

        所以,恰好你要用高度降解的FFPE样本进行转录组分析,恰好我有SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian虽然都说人间不值得,但你值得拥有它!

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