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 Capturem，让蛋白质质谱检测流程更加流畅 在如今的生物药物领域，生物制剂如重组蛋白质、单克隆抗体的开发呈现出快速增长的趋势。因此尽快开发出生物基质样品（例如血浆）中蛋白质类治疗药物的检测方法，对阐明其在动物与人体的药代动力学（PK）与毒理学性质至关重要。传统的免疫分析法应用于蛋白质药物检测，具有灵敏度高特异性强的优点，但也有不足，例如线性范围窄、基质干扰以及相对较长的方法开发周期（可能需要2-3个月）等。 质谱（MS）是蛋白质组学中对来自多种生物和细胞类型的蛋白质进行表征分析的主要技术，近年来，随着LC-MS/MS技术在蛋白质类药物生物分析领域的应用，已可将方法开发周期从以前的2-3个月缩短为1周，同时该技术还具备专属性强、线性范围较宽、精密度及准确度高和功能丰富等优点。 质谱分析中最重要的步骤是样品制备，需要将蛋白质转化为肽。使用胰蛋白酶是酶解消化蛋白质进行分析最常用的手段。它是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶，在赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧切割，产生MS分析最佳大小的肽。因此，快速和完全消化对于详细的蛋白质表征分析非常重要。 目前传统的样品制备操作是在胰蛋白酶溶液中37°C过夜消化处理。但是蛋白质的长时间消化可能造成氧化或其他蛋白质修饰，导致灵敏度差，从而降低了溶液内消化的可重复性，并且也不适合自动化。此外，酶解产生的信号肽的多少以及长短会直接影响到检测方法的准确性和灵敏度，从而影响了对蛋白质的定量及鉴定。 Capturem™ Trypsin和Pepsin可快速、有效、完全地消化蛋白质样品，在室温下让MS工作流程更加连贯。该系列产品应用我们的新型Capturem膜技术，膜上固定有胰蛋白酶（Trypsin）或胃蛋白酶（Pepsin），最快仅需2-3分钟的时间即可高效消化蛋白质样品，能进行独立样品酶解，也可进行96 well的高通量酶解操作。不仅可以节省时间，还可以通过减少胰蛋白酶自溶来改善蛋白质组学分析中肽和蛋白质的鉴定。 Capturem™ Trypsin消化全细胞裂解物的蛋白质组学分析 使用Capturem™ Trypsin对由BT474导管乳腺癌细胞制成的全细胞裂解物进行蛋白质组学分析，以尽可能多的鉴定独特蛋白质。变性的全细胞裂解物通过RP-HPLC（图1-A）被分成独立的19份，对每份样品用Capturem™ Trypsin消化。 表1中提供了使用Capturem™ Trypsin消化的每份样品的蛋白质含量。针对每份样品消化的产物进行单独的LC / MS-MS分析。图1- B显示了对每份样品鉴定得到的独特的蛋白质的数量。最终，使用Capturem™ Trypsin对BT474细胞酶解消化后进行蛋白质组学分析共鉴定得到了2,320种独特蛋白质。
Capturem™ Trypsin在进行高通量酶解消化时的孔间重复性 在肽的相关研究中，通常使用特征鲜明的蛋白质作为标准，这里我们选择apomyoglobin (Apo)来展示Capturem™ Trypsin 96 well plate的重复性。
【用户感言】 Dr. Michelle R. Robinson，来自美国默克(MERCK) 制药公司，默克研究所药代动力学及药效动力学部门。 他提到，使用金标准“自下而上（bottom-up）”法进行LC-MS分析前，免疫亲和纯化和酶消化处理是广泛使用且至关重要的样品处理步骤。如果应用Capturem技术进行免疫亲和纯化和酶消化处理，将大大缩短实验操作时间。他以两种单克隆抗体标准品为样品，使用Capurem进行免疫亲和纯化和酶解消化，再进行LC-MS定量分析以评估Capturem的使用效果，结果酶消化步骤由传统溶液法的4-18 hr缩短成3 min，免疫亲和纯化步骤由现有的2hr（自动化操作系统）加速为5min（Capturem）。除此之外，Capturem还能够显著增加实验通量达10-20倍。 |
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