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Takara真香推荐——简便好用的液态活检解决方案之细胞外囊泡篇


细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EV)是细胞在静息或应激状态下释放的各种具有脂质双层膜结构的囊泡总称,主要由外泌体微囊泡和凋亡小体组成,广泛存在于细胞培养上清以及血液、尿液等体液中。

EV中包含母细胞相关的蛋白质、脂类、核苷酸(包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA等)和糖等多种生物活性物质,参与细胞之间的信息传递,能维持各种生理过程,调控诸如传染、神经系统、心血管和肿瘤等疾病分子机制。

不仅如此,EV由其表面蛋白质的优势,可以被改造为疾病治疗工具,如疫苗或药物输送媒介。因此对EV及其内含物的研究给转化医疗领域的发展带来了希望,受到科研工作者的广泛关注。特别是EV来源的RNA,已有大量“它们可以作为肿瘤等恶性疾病早期生物标志物”的报道见各大期刊。

对EV来源RNA的分析,NGS是主流技术;同时,科研人员也会采用qPCR对EV RNA进行定量。
不过,EV自带的难点,使得对它的正确分析,“难于上青天”↓
(1)EV的体积小、密度低、分离难度大,传统方法获得的EV纯度低;
(2)EV RNA NGS文库构建成功率低;
……
为此,Takara打造了“一条龙”EV解决方案,让您享受从EV富集到NGS建库、高通量qPCR分析的畅快体验!

    Takara Capturem 技术:无需超速离心,柱式法30 min内完成EV分离,更纯更方便!

做好EV研究,高品质的EV分离与富集是关键!

目前,超速离心是较为常用的EV分离技术。但这种技术耗时长、重复性差、产物纯度低,需要超速离心机;长时间的离心又会对EV造成损伤,致使所获取的EV质量偏低。因此,这种“不标准”的EV分离技术,越来越难以满足科研人员日益增长的实验需要。

为实现EV分离更简便、更标准、重复性更佳,Takara科学家研发推出了Capturem™ Extracellular Vesicle Isolation Kit 该Kit采用Capturem新型膜技术,膜上偶联基于凝集素的EV结合化合物,无需超速离心即可在30 min内从血液、尿液、唾液等体液中分离出高纯度、足够量的EV,且操作重复性好,适于下游的转录组测序、蛋白质组分析或者是qPCR分析等应用。



操作简便,只需500g离心洗涤、洗脱等几步操作,即可获得一致性高、纯度高的EV产物。


Capturem分离的EV,纯度更高。采用两种方法从500 μl血浆中分离EV,重复三次。结果显示,Capturem捕获的EV粒径变化范围小,平均粒径大小为81 nm(D90=110 nm),超速离心法获得的EV粒径变化范围大,平均粒径大小为135 nm,(D90=203 nm)。


Capturem用更少量血浆就能获得足量的EV RNA!

EV来源的RNA是研究人员重点关注的对象,但无论是RT-qPCR或是NGS分析,都需要足够量的起始RNA。

本实验例分别采用Capturem和超速离心法分离EV,随后使用NucleoSpin miRNA Plasma提取EV miRNA,并用Bioanalyzer分析RNA品质。使用Capturem EV kit(Mini)仅从50 μl血浆分离的EV就能获得约100 pg/μl RNA,而超速离心法需要约300 μl的血浆才能获得相当量的RNA。此外,使用Capturem EV kit(Maxi)从大量样本中提取的EVs,同样可以获得稳定的RNA收量。


    Takara Pico v2:微量!无需前处理rRNA!链特异性! EV RNA-Seq更简便正确!

EV中微量的RNA分子可随着EV经循环系统传递到靶组织吸收,并在靶组织发挥蛋白质表达、转录调控等重要生理作用。因此采用NGS技术解析EV中编码(e.g. mRNA)与非编码RNA(e.g. lncRNA)的组成与差异表达,意义非凡!

但是,在对EV来源RNA进行NGS解析时,往往面临以下建库难题:

  • RNA含量低、存在一定降解
  • 存在rRNA干扰

针对上述难题, SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian(Pico v2均可一一解决↓

  • Pico v2支持pg级别total RNA起始,即使RIN值低至2,也可获得高品质链特异性的Illumina文库。
  • Pico v2采用Zap R、R probes技术,使得无需前处理rRNA变成可能;操作更简便的同时,去除了rRNA的干扰。

由于性能备受好评,Pico v2已被大量用于EV中编码及非编码RNA的NGS分析!

客户实例:

北京恩泽康泰研发团队选取了9例血浆EV来源的Total RNA作为起始样本,input量约为2 ng,采用Pico v2进行文库构建,并用于lncRNA、mRNA的分析。从数据中可以看出当FPKM≥1时,lncRNA检测数为2,000-4,500,mRNA的检测数接近10,000!数据质量良好!


以上图片与数据来源于北京恩泽康泰生物科技有限公司

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应用文献

Mateescu B, Kowal EJ, van Balkom BW, et al. Obstacles and opportunities in the functional analysis of extracellular vesicle RNA - an ISEV position paper. J Extracell Vesicles. 2017

Kim H, Bae YU, Jeon JS, et al. The circulating exosomal microRNAs related to albuminuria in patients with diabetic nephropathy. J Transl Med. 2019

Ono R, Yasuhiko Y, Aisaki KI, Kitajima S, Kanno J, Hirabayashi Y. Exosome-mediated horizontal gene transfer occurs in double-strand break repair during genome editing. Commun Biol. 2019

Rodosthenous, et al. Profiling Extracellular Long RNA Transcriptome in Human Plasma and Extracellular Vesicles for Biomarker Discovery. iScience .2020


    Takara SmartChip qPCR system:帮您节省时间,大量样本的EV-RNA定量也能快速正确完成!

除了NGS分析,EV中RNA的qPCR定量也是大多数研究人员选择的方法,特别是miRNA的定量。

同时,临床科研工作者往往有大量的EV RNA样本亟待分析。面对数量巨大的样本和检测位点,除了耗费科研人员的人力、时间、成本外,实验操作带来的误差也不可忽视。可一次分析多达上百样品的高通量qPCR系统的出现大大降低了大样本量检测的实验难度,提高了正确度!

SmartChip Real-Time PCR System是高通量qPCR系统的代表之一,一次可在特制的SmartChip芯片上同时进行最多5,184个qPCR反应。灵活的检测引物数与样品通量的组合方式,2小时即可完成qPCR反应和数据分析。100 nL反应体系,既保证检测的灵敏度,又节约了试剂成本,同时降低了实验误差!

SmartChip Real-Time PCR检测引物与样品组合方案


SmartChip Real-Time PCR系统凭借高通量、灵活性强的特性帮助许多研究人员对各类型样本中的核酸进行检测分析。

Takara Bio USA的科学家应用SmartChip Real-Time PCR系统对Capturem分离的EV样本同时进行了1,200个miRNA靶标筛选,结果检测到108个miRNA,对表达量前8的miRNA进行了芯片外验证,结果显示miR-548w,miR-496,miR-744-3p,miR-660-3,miR-3167和miR-376A-3p在分离的EV样品中拷贝数最高,其中很多microRNA已鉴定过在血浆来源的EVs中表达量较高。



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灵活、高通量的SmartChip qPCR系统助力您的Gene Expression和Genotyping分析!



Chris Sontag博士将在webinar中为大家详细介绍SmartChip Real-Time PCR System。SmartChip系统可以进行高通量的real-time PCR,用于基因表达分析和SNP基因分型研究。通过Chris Sontag博士的讲解,大家会进一步了解SmartChip系统的性能,以及它在多种研究领域中的良好表现,包括抗生素抗性基因研究、癌症相关的miRNAs研究、人血液样本和动物样本的基因分型研究等。欢迎大家的参与!


关键词总结:

Capturem新型膜技术实现EV快速高效分离
:30 min简便操作、无需超速离心、纯度高
Pico v2攻克EV RNA建库难题:兼容微量&降解EV RNA、rRNA干扰小、链特异性、编码&非编码同时分析

SmartChip系统平行开展大规模EV RNA qPCR分析:多至5,184反应/Rxn、100 nL反应体系、成本低、用时短

温馨提示:若您对上述内容感兴趣,请联系我们详细咨询:service@takarabiomed.com.cn


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