行远自迩，踔厉奋发—PCR基础知识介绍（一）
PCR作为一项基础的分子生物学技术，由于操作简便、省时、灵敏度高等优点，在生物科学研究领域应用广泛：从克隆、基因编辑、下一代测序（NGS）到基因分型、法医侦查、病原鉴定等，都离不开PCR技术的助力分析。
行远自迩，踔厉奋发，笃行致远，砥砺深耕。Takara作为提供PCR制品的重要企业，为了满足众多研究人员的需求，也在一直不断地完善与进步。以匠人精神，致力于新产品的开发；以专业的精神，严谨科学的态度，分享PCR基础知识。
本期讲堂，作为PCR基础知识的开篇，我们先来了解一下最基础的PCR原理、操作流程、成功的要素这三部分内容。 |
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一、PCR原理
PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的英文首字母缩写，它是一种体外扩增的方法，通过DNA链的热变性、引物退火和聚合酶作用下引物的延伸三个步骤，循环往复，达到在短时间内大量扩增目的基因的目的。
理论上，每一轮循环可使DNA的数量增加一倍，经过n次循环后，反应混合物中所含的DNA数量为2n。
二、PCR操作流程
①DNA制备
从样品中提取PCR反应所需的DNA模板、直接PCR无需此步。
推荐商品化的核酸提取试剂，节省时间、简化操作流程、减少DNA提取量的损失。
②PCR反应
包括反应液的制备和PCR反应两个步骤。
反应液的制备
普通PCR的反应体系由DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4 种dNTP、引物及靶序列DNA模板这五大要素组成。商品化的DNA聚合酶，一般包含了适宜浓度的dNTP及最适反应缓冲液，因此仅需我们准备引物及DNA模板，并且根据说明书推荐量进行反应液配制即可。
PCR反应
选择适宜的梯度PCR仪，根据扩增片段大小及酶制品说明书推荐来进行PCR反应条件设置。
③电泳、染色
PCR反应后，通过凝胶电泳确认扩增片段大小。
三、PCR成功的要素
DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4 种dNTP、引物及靶序列DNA模板是构成PCR反应组分的五大要素，这是影响PCR成功的内因；PCR反应条件的设置，是影响PCR成功的外因。
酶、buffer（Mg2+）、dNTP
之前提到过商品化的DNA聚合酶，一般包含了适宜浓度的dNTP及最适反应buffer，因此酶的选择至关重要，我们需要兼顾保真性、扩增特异性、扩增速度、扩增效率、模板复杂程度及扩增片段长度等，选择最适PCR酶。
引物
PCR反应引物的终浓度一般在0.1μM～1μM之间。引物浓度低，扩增产物少；引物浓度高，容易出现非特异扩增及引物二聚体。
PCR引物的设计，一般要遵循如下的设计原则：
| 引物设计原则 |
| 引物长度 |
17-25 mers |
| GC含量 |
40-60%(最好45-55%) |
| Tm值 |
两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值 |
| 序列 |
△ 整体上碱基不能过偏
△ 避免T/C连续，A/G连续
△ 3’末端碱基最好为G或C，尽量避免为T |
| 互补性 |
△ 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列
△ 引物3’末端避免2 base以上的互补序列 |
| 特异性 |
使用BLAST检索，确认引物特异性 |
模板
模板的完整性要好，模板降解会导致PCR扩增无产物。同时模板纯度也尽量越纯越好，纯度不好，可用PCI（苯酚氯仿抽提）及EtOH（乙醇沉淀 ）精制。
模板添加量可以参考酶制品说明书及下表的建议模板量进行添加，加量过多会导致非特异性扩增产物增加：
| 50 μl 体系建议模板量 |
| 人基因组DNA |
5 ng～200 ng |
| 大肠杆菌基因组DNA |
100 pg～100 ng |
| Plasmid DNA |
10 pg～1 ng |
| cDNA Library |
1 ng～200 ng |
反应条件
PCR反应条件可以参考酶制品说明书及下表进行设置：
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