使用In-Fusion无缝克隆技术做诱变 突变是研究基因结构与功能的最基本的手段，根据目的基因突变方式不同，包括定点诱变和随机诱变。目前以诱变改造生物体的技术已经经历了从整体 (细胞)到局部(基因),从体内、体外的随机诱变到体外的定点诱变。其中定点诱变是在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术，包括盒式诱变、寡核苷酸介导的定点诱变及以PCR为基础的定点诱变，已成为分子生物学研究的常用方法。
近几年来，以PCR为基础的定点诱变得到了不断的创新和改进，其突变体的回收率高，并且方便、快速、准确，所以倍受青睐。常见的有重叠延伸PCR、大引物PCR法、环状诱变PCR法以及靶向扩增突变链(TAMS)定点诱变法，其中以反向PCR为基础的环状诱变PCR法，传统的操作是设计一对含预期突变的互补诱变引物，以环状质粒为模板进行一次PCR扩增，对产物进行末端平滑化及5’磷酸 (P) 化处理，然后在连接酶的作用下环化并转化感受态细胞。
如果觉得产物末端平滑化及5’磷酸化处理稍显复杂，而且希望有比平末端连接更高效率的环化方法，那么不妨请出我们的“老朋友”——In-Fusion无缝克隆技术！
是的！没错！就是那个通过一个15分钟的反应步骤即可有超过95%的概率成功的将1个或多个PCR片段按照设计要求插入到任意载体的任意位置的高效率无缝克隆试剂！
当反向PCR遇上In-Fusion无缝克隆技术，就可以使诱变操作变得很简单！只需设计好引物，使其5’末端含有彼此重叠的15 bp序列以及加入的目标突变，实验时使用PrimeSTAR® Max高保真DNA聚合酶进行PCR，然后向线性化PCR产物中加入In-Fusion Snap Assembly Master Mix，再转化至Stellar™感受态细胞中即可，不需要进行产物末端处理，连接酶也不需要啦！更重要的是——它就是你做克隆实验一直使用的试剂，一盒多用，根本不需要额！外！购！买！
有了In-Fusion助力，你可以轻松进行缺失诱变：
进行插入或替换诱变：
使用In-Fusion做诱变实验概述：
1. 设计最终想要得到的结构体。选择想要修改的载体并设想最终的突变结构体（图 1，黄色表示突变）。
2. 设计引物。设计在 5' 末端有15 bp重叠序列的反向引物，同时包含入所需的删除、替换或添加序列。诱变引物设计的具体指南参见下方。
3. 借助In-Fusion技术的力量。使用新设计的引物按照反向 PCR的流程扩增载体。对PCR产物进行In-Fusion克隆，这时线性DNA将在 15 bp 重叠序列的位置重新环化，同时还将包含突变部分，再参照In-Fusion的操作流程转化Stellar感受态细胞。
4. 获得最终结构体。第二天从Stellar细胞中回收突变体。
图 1. 使用In-Fusion技术进行诱变的过程。黄色表示发生突变的区域。实验设计完成后，在Day 1按照上述步骤3进行实验，在Day 2回收最终结构体（上述步骤 4）。注意：虽然本文所有示例都属于蛋白质编码（基因）序列，但也可以使用相同的方法来修饰非编码序列，例如启动子或转录因子。
总结一下多才多艺的In-Fusion：
In-Fusion就是这样一款不断给你带来惊喜的宝藏试剂，现已加入秋促豪华列表，7.5折大放送进行中，买Snap系列还有京东卡拿，你还在犹豫什么？快来感受它在科研生活中给你带来的快乐吧！
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