Alexandra R. Keegan, Stella Fanok,Paul T. Monis,&Christopher P. Saint2
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May 2003, Vol. 69, No. 5, p. 2505–2511
        小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）污染是对水工程的一个挑战也威胁到公众健康。在此项研究中，我们开发了一种细胞培养-定量PCR分析法来评估消毒后小隐孢子虫的活性。我们用这种方法对水工程中多种消毒法包括低压紫外光（LP-UV），臭氧，混合氧化剂（MIOX），氯气进行评估。证实该检测方法是可信和敏感的，最低能检测到一个感染卵囊。有效的卵囊消毒(灭活率>2 log10 units)是采用LP-UV(20 mJ/cm2)或2 mg臭氧/公升（10分钟）。MIOX和氯气消毒卵囊效果最差（灭活率<0.1 log10 unit）。这些结果证实了MIOX对小隐孢子虫消毒的无效性。该检测方法是对饮用水和循环水消毒系统有效的评估方法。
简 介：
        小隐孢子虫是人类水源性疾病最常见的致病原。该疾病在世界范围内都有文献报道，推测很多未能确诊的肠道疾病可能都由这种寄生虫引起。感染饮用水系统和游泳池是两种传播途径。标准氯气消毒步骤能有效屏障其他饮用水中的水生病原体，却不能杀死小隐孢子虫的卵囊。尽管一些消毒措施能分离卵囊，但是存活下来的卵囊由于其对氯气消毒的耐受性，对人类健康仍是一种潜在威胁。多个研究小组已调查了各种消毒方法，这些方法包括UV光，臭氧混合氧化剂（MIOX），和氯气。一些消毒研究中用感染动物或替代品体外检测来确定消毒后卵囊的活力。动物活体测试被认为是检测小隐孢子虫卵囊感染的“金标准”。新生鼠模型在预测卵囊消毒效果中广泛使用。但是这种模型在检测水生病原体卵囊时有局限性，因为1型（人）小隐孢子虫不能感染小鼠，而可以在无菌猪上培养，后一种模型已经用来检测药效。
        在对1型和2型隐孢子菌卵囊细胞培养的检测中，卵囊消毒测试效率有了显著的提高，这些方法包括使用培养人类回肠腺癌细胞（HCT-8）上的卵囊。对这种方法进行评估显示，对HCT-8细胞系的细胞培养检测（CC测试）可以等同于使用新生鼠消毒检验金标准。SHIM等都证实当使用低压UV光（LP-UV）对小隐孢子虫消毒时，CC测试提供的检测敏感度类似于小鼠活体检查。Rochelle等通过比较CD-1小鼠活体测试中的多个细胞系来确定剂量反应性和50%感染剂量。CD-1小鼠和三种CC模型的感染性关系显示HVT-8细胞的感染检测与未处理卵囊(r = 0.85, n = 25)，卵囊暴露于臭氧和UV-光的三种CD-1小鼠(r = 0.85, n = 25)相当。这些结果证实体外培养细胞与小鼠消毒测试金标准等同，可以成为对检测卵囊消毒及灭活效果的一种替代方法。使用可持续的细胞系可以避免与动物伦理相关的问题。
        用于细胞培养感染的分析方法有很多种，如逆转录PCR，荧光显微镜，原位杂交比色法。这些方法通常需要大量时间，涉及抽提mRNA或可用于显微镜扫描的相当数量的标本。实时定量PCR（Q-PCR）的出现对隐孢子菌细胞培养感染性的检测和定量提供了快速分析的优势。它不需要电泳和密度计量即可以对PCR扩增产物实时定量。最近开发出一种检测抗隐孢子菌药物效果的Q-PCR测试法被

证实有着良好的可重复性及高度敏感性。在此项研究中我们展示了一种可以对CC中感染水平进行定量的快速诊断方法。为了获得此目的我们将标准CC技术和能对卵囊消毒水平进行实时定量的Taqman PCR技术结合起来。该方法针对了多种消毒方式，包括UV光，臭氧，MIOX，和次氯酸盐进行了检测。

材料与方法
        C.parvum牛分离卵囊（Swiss cattle C26）购自U..Ryan兽医和生物医学部。卵囊根据Meloni和Thompson(1)和Hijjawi（2）报道的方法从鼠身上传代。卵囊保存在无菌的加有抗生素（15μl/ml）磷酸盐缓冲液里（PBS）,抗生素溶液含有ampicilin(10mg/ml)和lincomycin(4mg/ml)。卵囊纯化（体外脱囊检测的存活率大于80%，）后的所有实验在6个星期内完成。
        卵囊计数。对所有的卵块进行标准计数。先用无菌双蒸水（SDDW）进行一系列稀释，将复制样品放在黑色聚碳酸脂0.8μm孔径膜滤器（Osmonics Inc.）上,用一个装有Swinnex 过滤支架(Millipore)的Qiavac Manifold真空抽滤装置（Qiagen公司）在200mbar的真空压力下抽滤（1 bar=100000Pa）。单克隆抗体 AusfluwCry104用抗体缓冲液中(含 5%[wt/vol]牛血清白蛋白的Isoton II)稀释到6.6μg/ml。一份（100μl）加到膜上的卵囊上并在室温下孵育15分钟，抗体溶液通过真空抽吸透过膜，并用Isoton II溶液（250μl）对膜进行洗涤，然后用4μl固定介质（甘油[非光反应性]，2ml；100mg DABCO[1,4-diazabicyclo[2,2,2]辛烷]/每毫升SDDW,2.4ml；0.1M Tris 缓冲液，4.8m；福尔马林，0.5ml；还有5MNaCl,o.5ml）将膜加到显微镜载玻片,并用盖玻片和dear nail varnish密封。所有的膜经过彻底扫描，并用荧光显微镜对所有卵囊进行计数（Olympus Vanox BX50），所有的计数进行三遍。
        消毒试验。（I）UV消毒试验。对每一份10000个卵囊进行紫外照射，用的是Starkey UV 消毒仓，内置两个15-W的低压汞蒸汽芽孢杀灭灯，能在253.7nm附近产生近似的单色光。UV放射通过一个IL-400A光电倍增管，在发射点进行测量。卵囊稀释在0.01M的磷酸钾缓冲液里（磷酸缓冲液由母液制备0.1M，39ml 0.2M的KH2PO4与61ml的0.2M K2HPO4混合[pH7.0]，在MQ水中稀释到0.01M）,pH7.0；每一份（100μl）放置在25-mm处理过的petri 碟（盖子打开），静置于22℃，UV照射的剂量从3到1000mJ/cm2(见表2)

（II）臭氧消毒试验。通过Ozat CFS仪器(Ozonia,Ltd.,Duebendorf,Switzerland)产生出臭氧化水。臭氧气体浓度是在估计分子吸收率为23150M-1cm-1的基础上通过靛三磺酸盐[酯]方法来测量，计算每微升臭氧化水中臭氧浓度，通过计算加到每个独立的反应管的合适剂量来计算应加入的体积。用250-ml Schott 瓶和0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）(以前描述过)来起始反应。在每个反应管中加入10000个卵囊的悬浮液来开始试验。所用臭氧浓度分别为1.0，2.0和5.0mg/升，反应终体积为200ml。通过来回颠倒5次来混合反应液，在22度温育10分钟。所有的反应（包括无臭氧对照组）用硫代硫酸钠（2ml1.67%[wt/vol]溶液）终止，上清液吸到离心管中，反应容器用50ml0.01% Tween 20漂洗，卵囊通过离心汇集（1800g 10分钟），大部分上清液丢弃，将凝聚物重新悬浮并转移到1.5-ml 离心管中。样品用无菌PBS加足1ml，分离出一份（100微升）与抗体溶液染色，用在显微镜下计数，剩下的通过离心（1800g 10分钟）进行浓