Sabina Solinas-Toldo, Matthias Dürst，&Peter Lichter
Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 94, pp. 3854–3859
第一部分：概述
与人类子宫颈癌密切相关的高危人乳头瘤病毒(HPVs)，如HPV16和HPV18，对培养的人类上皮细胞有潜在的促永生化作用。四个HPV转染的角质细胞系通过比较基因组杂交法在转染后不同时间点进行分析。发现许多染色体的不平衡性是培养物永生化过程中高度特异的现象。尽管其中几个是新发现的，以前没作为子宫颈肿瘤的再发性异常现象，有些却与子宫颈癌变期间观察到的染色体变化相同。这些数据从新的角度强调了所研究的细胞体系可作为HPV诱导的发病机理的相关模式。
第二部分：导言
特异类型的人类乳头瘤病毒（HPV）在生殖肿瘤的病因学的中起着关键作用。尤其是HPV16和HPV18被认为是引发子宫癌的关键因素（1）。在多数子宫颈发育异常病变中，都能发现这两种病毒类型中的一种。浸润子宫颈癌之前，癌前病变（子宫颈上皮内的癌变(CIN)）已从轻度或中度发育异常(CIN-I and -II)发展到重度发育异常（CIN-III），也称为“原位癌”。癌前病变到浸润子宫颈癌变的过程通常需要几年甚至几十年。有大量的证据表明子宫颈癌变的多阶段性。除了肿瘤形成中被认为是必要但不充分的病毒基因E6和E7，宿主基因组中特定基因遗传突变也被认为有助于恶性化进程。
致癌的生殖器 HPV 类型，如HPV16， HPV18 和 HPV33 能使培养的人的原代上皮细胞永生化。HPV6及HPV11不具有此特性，它通常只引起良性病变。永生化代表HPV 诱导的恶性转化多级演变的第一个步骤。尽管永生化只定义了培养细胞表型状态，仍有证据显示此状态与低级的HPV阳性子宫颈癌前病变有关。HPV相关的肿瘤化的细胞培养物模式系统因而在分析子宫颈癌变方面非常有用。病毒蛋白E6,E7分别通过干扰宿主细胞的关键调控蛋白，如p53 和 pRB促进永生化。尤其是E6蛋白的表达，它与 p53 的相互作用，似乎是造成被感染细胞染色体不稳定性的原因。
HPV永生化细胞能获得恶性表型，例如： 经RAS癌基因转染后，通过γ照射和长期传代培养方法结合甚至仅用长期传代法。这已经用来为HPV诱导的致癌研究建立细胞培养体系，可能将用来描述细胞转化中相关事件的顺序。就某些细胞系而言，遗传分析与体细胞融合实验互为补充。
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显示这种永生化和致癌性表型都是隐性形状，同时他们之间是相互独立的。通过研究不同起源的转化细胞系，Pereira-Smith和他的同事报告了至少四个不同永生化补充组的证据。HPV永生化细胞和起源于子宫颈癌的细胞可被归为一个组，暗示了其与HPV诱导的永生化有共同的机制。
为了确定与永生化相关，可能也与癌前病变发展早期相关的遗传不平衡性，我们通过比较基因组杂交（CGH）技术分析了HPV转染的角质细胞。采用CGH技术，整个基因组的肿瘤DNA被不同标记的正常基因组DNA共杂交到正常的中期染色体上。通过对沿染色体上两种DNA探针杂交信号强度的后续比较可以评估染色体的不平衡性；肿瘤DNA上信号过量及不足的染色体区域表明了荧光信号值的升高或降低。此研究中，不同来源的HPV16或HPV18永生化的角质细胞系转染后在不同时间间隔进行CGH分析。
第三部分：材料方法
细胞培养条件：
在培养中HPV永生化细胞的建立通过将克隆的完整HPV16 或 HPV18基因组转染人类原代包皮角化细胞后，筛选无限增殖培养物而来。在原代或第二代培养物接近铺满前，通过DNA－磷酸钙沉淀或Lipofectamid 方法转染HPV16或HPV18的DNA。在细胞铺满时按照1：2的比率进行传代培养。每一代中，有50% 的细胞被冻结的在液氮中，另50%用作DNA 抽提。在4到5个时间点抽提DNA是为评估在永生化过程中病毒DNA的状态以及鉴定与表型相关的遗传变异。
Southern 分析
抽提细胞的DNA；用限制性酶消化；在 0.7% 琼脂糖 胶体上电泳，在尼龙膜上印记；杂交采用 50%甲酰胺， 5 × SSC ， 50 mM的磷酸钠（pH 6.5）, 5 × Denhardt's 在42℃杂交；0.1个毫克／毫升 tRNA, 和 1% SDS，胶纯化；32 P 标记的 HPV16 或 HPV18 DNA（>5 × 108cpm／ug）做探针；在-70℃柯达 X－ Omat AR 相纸照相曝光。
比较基因组杂交
抽提不同时间点的细胞系的基因组DNA，用于比较基因组杂交测试。准备中期染色体，DNA的标记，杂交按文献操作。中期染色体来源于女性的外周血白细胞,对照DNA抽提自一名健康男性的外周血淋巴细胞。测试和对照 DNA 通过切口平移法分别用生物素标16- dUTP 和地高辛标
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