Baback Gharizadeh, Mina Kalantari, Carlos A. Garcia, Bo Johansson, and P?l Nyrén
LABORATORY INVESTIGATION，Vol. 81, No. 5, p. 673, 2001
摘要：本研究的目的是为了探讨使用Pyrosequencing技术，一种新的依靠生物发光进行DNA序列分析的技术，进行人乳头状瘤病毒（Human papillomaviruses，HPV）研究的可行性。67个使用GP5+/GP6+引物PCR扩增的样本，在HPV检测板中通过Pyrosequencing进行双盲检测。对这67个DNA样本测序25个碱基，并且使用BLAST搜寻其序列。使用Pyrosequencing可以对所有这些样本进行正确的分型，并且结果完全与常规的测序技术所得到的结果相吻合。我们认为Pyrosequencing是一种快速、高效的进行HPV分型的工具。此外，与使用Pyrosequencing进行HPV序列突变研究一样，它还可以被用来进行常见的HPV基因分型。这个方法重复性很好，而且非常适合于大通量的研究工作。（Lab Invest 2001,81:673–679)
        人乳头状瘤病毒（Human papillomaviruses，HPV）属于Papovaviridae家族。它携有成环状的双链DNA结构，大约长8kb（Godfroid et al, 1998），它编码了几个已知的调控和结构蛋白，如早期（E）的E1，E2，E4到E7，以及晚期（L）的L1和L2。这些蛋白与病毒的复制和致癌性转化属性相关(Poljak et al, 1998; Schneider, 1993)。

        共有100种以上不同的HPV基因型，其中超过30种可以感染宫颈黏膜的基因型，已经对其进行了基于DNA序列同源性的鉴定(Chan et al, 1995; Vernon et al, 2000)。由于所有的HPV基因型都高度相关，可针对基因组上的保守区域设计检测方案，或针对最能分辨不同HPV基因型的区域进行检测。一致性检测用针对HPV基因组相对保守区域的引物。扩增的产物再通过特异基因型探针点杂交，限制性片段长度多态性分析，或是DNA胶电泳测序等方法来进行分型（Vernon et al, 2000）。

       目前有一种可以替代以上几种HPV分型的新方法，它基于生物发光的，不需要DNA电泳，被称作Pyrosequencing技术(Ronaghi et al, 1998)。这项技术利用几个酶的级联反应，通过DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和荧光素酶来监测DNA的合成，同时，用一个可以降解核酸的酶，使反应体系复原，进行下一轮的核酸结合反应（Fig.1）。这项技术具有准确、灵活、实时监控和易于自动化操作的优势。而且，它不需要荧光标记的引物或是核酸探针，无需进行电泳。

        由于在进化的过程中HPV的基因组保持了高度的稳定性和保守性（Chan et al, 1995），因此，即使基因组中很小的片段，也可以用来进行可靠的分型。位于L1一致区域（consensus region），紧随GP5+ primer位点下游的50个碱基，足以用来区分最为常见的生殖器HPV的基因型。在这篇文献中，我们探讨用Pyrosequencing技术对HPV样本扩增产物的20－40个碱基进行序列分析，以区分不同的HPV基因型。在这个双盲检测实验中，我使用Pyrosequencing对来自于不同个体的67个临床样本进行基因分型。结果与常规的DNA序列分析数据进行比较确认。样本事先使用type-specific PCR进行基因分型。

结果：
        在HPV检测样品板中包含来自于不同个体的67个样本，通过双盲实验（blinded clinical test）扩增L1保守区段的150bp的片段。使用通用的引物GP5+和生物素标记的GP6＋。67个样本中的12个直接用其细胞裂解液扩增。另外的55个样本使用抽提的DNA进行扩增。PCR的扩增效率通过EB染色和胶电泳进行检测。
        获得的单链模板与GP5＋测序引物杂交，然后用Pyrosequencing检测每个样本的HPV基因型。目的是对样本进行20至25个碱基的序列分析。紧随GP5+引物下游的，位于L1保守区域的14到40个碱基足以进行常见HPV基因型的分型工作。
        将Pyrosequencing检测获得的序列信息，用BLAST(http://www.ncbi.- nlm.nih.gov/BLAST/)搜寻HPV基因型。为了确认结果的准确性，我们又用常规的