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不同的白血病在它们的质膜上表达247个特定的区别抗原(CD抗原)，这些抗原可能代表了前体细胞沿着分化系统分化成成熟骨髓细胞和淋巴白细胞。CD抗原表达（免疫组型）在鉴定白血病上是应用流式细胞检测，它一般只能辩认三个CD抗原。通常，结合形态学、免疫组型、细胞化学和染色体组型方法来诊断白血病和淋巴瘤。我们已发展了一套简单方便的方法，它运用抗体芯片能同时检测50甚至更多的在白细胞或白血病细胞CD抗原。那些表达相应的CD抗原的细胞能与芯片上的抗体结合。对白细胞数目急剧上升的患者，相应的表达模式表现出这些细胞的免疫组型。对疾病早期患者，根据与正常白血球不同的表达模式来诊断疾病。人们已经在正常外周血白细胞、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、毛细胞白血病、斗篷细胞淋巴瘤、急性骨髓白血病，以及T细胞急性成淋巴细胞白血病上获得了独特的表达模式。在CLL细胞上的CD抗原的表达模式来自20个患者，这些患者按细胞结合的递减次序依次为CD44,
HLA-DR, CD37, CD19, CD20, CD5, CD52, CD45RA, CD22, CD24, CD45, CD23, CD21, CD71, CD11c, 和 CD9。 能辨别CLL与正常外周血白细胞最好的抗原是CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, 和 CD37。48个CD抗原的表达分析比流式细胞分析更为有优势。芯片能进行广泛的免疫组型分析，以及结合到抗体芯片上的细胞可以进行进一步的鉴定，如使用可溶性的、荧光标记的抗体。
引言
血液细胞起源于干细胞。干细胞可在细胞因子如集落刺激因子的控制下，分化及增生扩散成骨髓与淋巴系统(1,2)。不同起源的前体细胞表达不同的表面分子，其中大部分表面分子，现在被定义为CD抗原。白细胞质膜上CD抗原与各种各样的生理功能相关，如细胞之间的相互作用，细胞因子受体，细胞信号转导，离子通道，转运蛋白，酶，免疫球蛋白以及各种支持分子（2）。当细胞随特定的系统分化时，CD 抗原的表达也随之变化，比如当表达CD43的骨髓干细胞分化成粒性白细胞时，接着开始表达CD13和CD33，并抑制CD34的表达。成熟的嗜中性粒细胞表达抗原CD11b,CD13,CD15,CD33的表达基本上被抑制了。白细胞的CD抗原的表达通常是根据流式细胞仪来检测。但是，流式细胞检测方法耗体力，价钱昂贵，需要荧光性标记的抗体，而且一次性只能分析3-4个CD抗原。
白血病的主要类型有源自未成熟T或B淋巴细胞的ALL，源自未成熟骨髓细胞的AML，源自成熟B淋巴细胞的CLL，源自粒细胞前身的慢性骨髓白血病（5）。由于循环的淋巴瘤细胞，NHL也被认为是一种白血病（5）。准确的血液诊断使我们可以选择最有效的治疗手段。目前，对急性白血病的诊断是根据对原始血细胞的形态学与细胞化学的分析，通常还要补充染色体组型及免疫组型的分析（5）。应用单克隆抗体对白血病进行流式细胞检测，对骨髓和淋巴急性白血病的诊断能达到98%的准确性（9），能区分一系列的慢性白血病与淋巴瘤（5）。根据WHO/FAB的标准，基于形态学分析，CLL可分为典型与非典型两个亚型（6，7），这有重要的预后意义。有很多研究表明，非典型的形态学，三体12和异常的免疫组型有很强的一致性（10）。
在AML中，突变可以引起发育改变，导致在特定分化期终止分化细胞的增殖。或者，AML起因于以特殊方式分化的白血病干细胞（11）。使用WHO/FAB的分类标准，根据形态学，与过氧化物酶和苏丹黑染料的反应，CD13、CD14、CD33、CD41、CD61和血型糖蛋白A的表达，细胞质颗粒的类型，奥尔棒，液泡，染色体位移（8；21 或 15；17），染色体16的倒置，11q23异常，非特异的酯酶和氯代醋酸盐酯酶活性，血清和尿中溶解酵素水平和周期的acid schiff 染色，AML被分为很多亚型（6，12）。Jennings和Food（4）综述了基于抗原表达的模式与强度，流式细胞仪在白血病和淋巴瘤上的应用。他们发现有限的免疫组型不能独特的定义FAB分类的AML。然而，50-100个抗原表达的筛选会产生与现存分类相一致的占多数的模式。同时，它为WHO骨髓瘤形成的分类的生物学水平上的相关修改提供了方便（6）。Bain（5）发现AML的8个不同的FAB亚型，其9个表面抗原的不同的表达水平。对ALL来说，免疫组型在分辨临床上相关的亚型起着重要的作用。WHO认为ALL应根据细胞与一组血统相关的抗体的反应的模式来分类（6）。
Golub 等（13）使用DNA芯片技术对来自38个患者骨髓的AML和ALL进行了基因表达研究。 对6817个基因进行了定量分析，大约有1100个基因在AML与ALL之间是差异表达的。50个基因与AML-ALL差异是紧密相关的，它们被用来对新样品进行更高精确的分类。Alizadeh等（14）使用一个含有17856个cDNA克隆的“Lymphochip”
对96个正常与恶性淋巴细胞样品的扩散大B细胞淋巴瘤的基因表达进行分析。鉴定出两种不同形式的淋巴瘤，它们的表达模式表明B细胞分化的不同阶段。寡核苷酸芯片在分类白血病或淋巴瘤中的使用，操作是实验式与复杂的，与现在的诊断标准（形态学，免疫组型，细胞化学和细胞遗传学）很难协调，缺乏临床上的相关性。而且，在mRNA与蛋白水平以及而后的翻译后修饰，还存在着不确定的关系。
Chang（15）证明了人外周血单核细胞与吸附于玻片上的小鼠抗人HLA-A2抗体（50nl）特异性结合，以及小鼠胸腺细胞与类似固定的抗 |
Lyt 2.1和抗Lyt 2.2的抗体结合。这种利用固定化的抗体来鉴定HLA抗原的同种抗免疫球蛋白的潜能，以及白细胞子集的比例已进行了广泛的讨论。但在这个程序上并没有相当大的发展。我们对这个方法进行了检测，我们把抗CD3，CD4，CD8，和CD19的抗体点在玻片上，然后与人Raji(B细胞Burkitt淋巴瘤)或CCRF-CEM（T细胞ALL）进行杂交。因此，我们发展了抗体芯片，称为LD芯片（纪念Lee Dixon）。
材料与方法
细胞系
从American Type Culture Collection (Manassas, VA)获得CCRF-CEM（急性成淋巴细胞白血病），Raji（Burkitt 淋巴瘤），以及HL-60（急性髓细胞前身白血病），并在RPMI 1640 培养基（Trace Scientific, Melbourne, Victoria, Australia）上生长。该培养基还添加有10%小牛血清(CSL Limited, Parkville,
Victoria,Australia)和50 mg/ml 庆大霉素硫酸盐(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)。
抗体芯片的构建
这个程序已在PCT的申请中提到。PixSys 3200 Aspirate and Dispense System (Cartesian Technologies, Irvine, CA)被用来构建一个矩形芯片（0.72cm×0.4cm），首先在载玻片（Fast Slides, Schleicher and Schuell）上固定上一层硝化纤维膜，再点上60个不同的5nl的抗体，然后凉干。抗体是从下列公司购买：Coulter and Immunotech from Beckman Coulter
(Gladesville, NSW, Australia), PharMingen from BD Biosciences (North Ryde, NSW, Australia), and Biosource International from Monarch Medical (Stafford City,
Queensland, Australia). 这些抗体是于-20℃保存在0.1%BSA中（Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia）,使用浓度在25-1000 mg/ml。在白光盒上我们用肉眼可以看到抗体圆点，芯片的角落用铅笔标记。硝化纤维膜用含5% (w/v)奶粉(Diploma; Bonlac Foods, Melbourne, Victoria, Australia)PBS缓冲液封闭（室温下90min ）,再用水洗涤，干燥，于4℃枯燥保存。每一批芯片都要用细胞系和冷冻的外周血白细胞或知道显型的白血病细胞，来检测抗体结合的活性。
白细胞与LD芯片的结合
正常人与白血病患者的外周血中分离白细胞（用EDTA或肝磷脂防止血液凝结）。首先使用Histopaque(Sigma Aldrich),作PBS洗涤，再用含1mM的EDTA的PBS重悬，使细胞达到 107个/ml，然后与LD芯片在室温下温浴30分钟（100ml悬浮液/片），没有结合上的细胞会被PBS柔和的洗涤掉。EDTA能明显的降低非特异性结合。热失活的人AB血清[10%（v/v）；Sigma-Aldrich]添加到AML细胞中，由于Fc受体结合，与所有的抗体结合。芯片再在含1%（v/v）甲醛（(Sigma-Aldrich)，2%（w/v）葡萄糖，以及0.05%（w/v）叠氮化钠的PBS中固定1h,然后再用PBS洗涤。
数据记录与分析
使用非常规的暗视野显微镜（如带UPLan 4×物镜的Olympus BX60 荧光显微镜），观察结合的白细胞。冷凝器安置在阶段1位置，绿色滤光片固定在光源上。使用SenSys digital cooled CCD camera (1317×1035 pixels;
Photometrics, Tucson, Arizona), PCI Frame Grabber, and “V” version 3.5 图象处理与分析软件（Digital Optics, Auckland, New Zealand）对图象进行记录和分析。使用Adobe Photoshop version 5.0 软件对图象进行处理,比较一套标准的强度渐增的矩阵来计算点密度。使用ImageQuant version 3.3软件进行量化分析。固定的芯片即使干燥以后，如果用PBS弄湿的话，重新可以在显微镜下观察。
流式细胞分析
分离出来的外周血白细胞（106个细胞）与FITC-或PE-结合的抗体（Coulter or Immunotech），以及2%（v/v）热灭活的人AB血清（Sigma-Aldrich）在室温下温浴15分钟。用FACS缓冲液（含0.1% (w/v) BSA 和 0.1% (w/v) sodium azide的PBS）洗涤后，细胞用定色剂重悬，在FACS-calibur flow cytometer上分析，用488纳米冷氩离子激光，运行CELLQuest 软件（Becton Dickinson, San Jose, CA）。
共聚焦显微观察
与白细胞温浴后，LD芯片再与CD3-FITC (Coulter; diluted 1 in 200 with FACS buffer) 和 CD19-PE
(Immunotech; undiluted) 1:1 混合的混合物于室温下温浴10分钟。使用FITC-和PE-结合的同型对照抗体进行特异性的结合的检测。玻片再用PBS缓冲液洗涤,用SlowFade Antifade Kit (Molecular Probes; from
Bioscientific, Gymea, Australia)进行固定。使用Leica TCS NT Confocal System (Microsystems, Heidelberg, Germany) 的Plan Opo 100×1.40–0.7 oil immersion objective，对玻片进行检测。使用Adobe Photoshop version 5.0 软件对图象进行处理分析。
结果
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