基因快讯2002年第3期   

结果
氧化磷酸化作用削弱的心肌细胞比正常细胞更能经受凋亡。
    我们对先前所说的组织特异Tfam 基因中断的转基因小鼠进行了研究，这种基因中断能引起小鼠出生后严重的线粒体性心肌症的发作（11）。Northern blots 的检测结果发现了糖分解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶和心房促尿钠排泄因子转录水平的提高（图1,A,B）,肌浆网Ca2+ ATPase2转录水平的降低（图1,A,B）。这种心房促尿钠排泄因子和肌浆网Ca2+ ATPase2基因表达的差异在动物及人心功能衰竭中普遍存在。（16，17）Tfam敲除心肌的组织学分析没有发现纤维症、坏疸或炎症细胞侵润（图2,A,B）。酶组织化学染色证实了上述的结果（11）并显示了马赛克样的呼吸链功能的低下的心肌层(图 2,C,D)。TUNEL对心肌切片的染色结果表明在Tfam敲除的心肌中，有TUNEL阳性细胞率的明显升高（图2 E,F和3B）。TUNEL检测并不是凋亡特异性的（18） 因此，我们还进行了DNA的凝胶电泳检测，对12份Tfam敲除的心肌样本中的5份进行典型DNA片断的检测（图3A）。免疫组织化学分析在Tfam敲除的心肌中检测到了活性caspase 3和caspase 7的表达(图2,G,I)，而在对照片中没有表达（图2 H,J）。

    Western blot 的检测发现在无血清或STP-处理的鼠胚胎纤维原细胞中有加工后的caspase3和蛋白激酶 的异构体存在，但在Tfam敲除的心肌中没有（图 3C）。来自Tfam敲除的心肌中的RNA的Northern blots 结果也显示了编码proapoptotic Bax和anti-apoptotic Bcl-x(L)蛋白转录水平的提高（图1A,B）,这表明调节凋亡的基因表达的提高。上述发现均说明Tfam敲除的心肌中凋亡水平升高，但没有表明激活的途径。

图1. Tfam 敲除的小鼠心肌(TfamloxP/TfamloxP, +/Ckmm-cre)和同窝出生对照小鼠(TfamloxP/TfamloxP)心肌中基因表达和酶活性轮廓图。

(A) Northern blots 显示Tfam 敲除的小鼠心肌(L/L, cre)和对照心肌(L/L)中心房促尿钠排泄因子(Anf)、肌浆网Ca2+ ATPase2 (Serca2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、Bax 、Bcl-x(L)、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)和线粒体超氧化物歧化酶(Sod2)的mRNA表达。核18S rRNA转录子作为对照。

(B) Tfam 缺失心肌(n = 4)和对照心肌(n = 4)中基因转录水平的PhosphorImager分析结果。*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001. 

(C) Tfam 缺失心肌(n = 8)和对照心肌(n = 8)中complex II (CII)、complex IV (CIV)、顺乌头酸(Aco)、总谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)和总超氧化物歧化酶(Sod)活性的生物化学检测。*, P < 0.05; ***, P < 0.001.

Tfam敲除的心肌活性氧簇的过表达通过超氧化歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的上调进行补偿。
    Tfam敲除的心肌与对照相比，通过Northern blots 和PhosphorImager 计数检测的Gpx 转录水平(164 ± 28%, P < 0.01) (图 1 A and B), 和通过生化检测的总Gpx酶活性 (120 ± 18%, P < 0.05) (图 1C),都有提高。对ROS失活高度敏感的顺乌头酸酶（19）活性和核编码呼吸链复合物II，在Tfam敲除的心肌中没有变化（图 1C）。Tfam敲除的心肌中存在Sod2转录水平（图1A,B）的升高和总Sod 酶活性升高的趋势（图1C）。这些结果表明在Tfam敲除的心肌中通过Sod 和Gpx 活性的诱导对ROS产物升高进行补偿。过去研究曾表明在氧压下p53蛋白水平提高（20）。我们通过组织切片免疫组织染色或Western blot检测总蛋白和核蛋白抽提物，在Tfam敲除的心肌中并没有检测到p53 的表达。

图2. Tfam 敲除的小鼠心肌(TfamloxP/TfamloxP, +/Ckmm-cre)和同窝出生对照小鼠(TfamloxP/TfamloxP)心肌组织学染色图。
样本中免疫反应性细胞通过箭头标出。三色染色结果显示在Tfam 敲除样本(A)或对照样本(B)都没有出现坏死或纤维化。COX活性和琥珀酸脱氢酶活性的双酶组化染色结果显示在染色呈蓝色的Tfam 敲除的小鼠心肌中有一个马赛克样的COX活性缺失(C)，而在对照心肌中，通过棕色心肌细胞染色，显示了正常COX活性(D)。TUNEL 染色结果表明在Tfam 敲除的小鼠心肌(E)比对照心肌(F)具有更多的TUNEL 阳性心肌细胞。前切后的caspase 3 和前切后的 caspase 7免疫组化染色结果显示了在Tfam 敲除的小鼠心肌中有非正常的阳性细胞(G and I) ，在对照心肌中则没有(H and J)

图3. Tfam 敲除的小鼠心肌(TfamloxP/TfamloxP, +/Ckmm-cre)显示凋亡水平升高。

(A) DNA ladders在Tfam 敲除心肌中存在 (heart, L/L, cre) 但在对照片 (L/L)中却没有。无血清和STP 处理的鼠胚胎纤维原细胞(MEF)作为阳性对照，未经处理的MEF 作为阴性对照

(B) Tfam 敲除的小鼠心肌(n = 15) 和对照心肌(n = 15) TUNEL 染色的Wilcoxon 配对检测结果表明在Tfam 敲除的小鼠心肌中TUNEL 阳性细胞有明显的增加 (***, P < 0.001)。

(C)前切后caspase 3 和剪切后蛋白酶C 异构体 (PKC ) 的检测分析。在Tfam 敲除的小鼠心肌(L/L, cre)和对照心肌(L/L)中没有检测到剪切后caspase 3 和剪切后蛋白酶C 异构体无血清和STP 处理的鼠胚胎纤维原细胞(MEF)作为阳性对照，未经处理的MEF 作为阴性对照

在E9.5 Tfam 敲除的纯合胚系中显示了大规模的凋亡。
    我们先前已经在鼠的胚系中中断了Tfam 的编码基因（12），结果Tfam 敲除的胚胎在E8.5 和 E10.5间就死亡。这些Tfam 敲除的胚胎在E8.5检测不到mtDNA 的存在，也没有功能性的呼吸链（图4 A-D）线粒体形态上也出现异常。仅在E10.5就重新出现了吸收妊娠（12）。此外，在E8.5检测Tfam 敲除的胚胎也没有出现TUNEL 阳性细胞率上升的现象。然而，在 E9.5 ，Tfam 敲除的胚胎出现了大量的TUNEL阳性细胞 (图 4 E and F), 免疫组织化学染色结果显示了活性caspase 3表达的升高 (图 4 G and H)， 而活性caspase 7 (图 4 I and J)表达没有升高。

    上述结果表明在缺乏mtDNA 、呼吸链功能低下的细胞中发生了大量的凋亡。

图4. Tfam敲除 胚胎(Tfam / )在E9.5出现大量的凋亡。针对COX活性的酶组化染色结果显示在 Tfam敲除胚胎中没有COX活性(A) 但在对照胚胎中COX活性正常 (B)。琥珀酸脱氢酶活性的酶组化染色结果显示在Tfam敲除胚胎(C)和对照胚胎(D)中活性正常。TUNEL染色结果显示在Tfam敲除胚胎(E)中存在大量的TUNEL阳性细胞（箭头所示）而在对照胚胎中很少(F)。免疫组化染色在Tfam敲除胚胎(G)中检测到大量的caspase 3（箭头所示）而在对照胚胎(H)中只有偶尔的阳性细胞。免疫组化染色在Tfam敲除胚胎(I)中和对照胚胎(J)中都没有检测到caspase 7 

      ⁰ Cells对各种凋亡诱导信号非常敏感. 呼吸链功能低下的鼠细胞凋亡出现升高的结果与其他研究中表明的缺乏mtDNA 的人细胞系对STP诱导的凋亡具有抗性的结果相反（9）。我们因此重新研究了缺乏mtDNA 的人143B 骨肉瘤细胞组织。我们用流式细胞仪（用annexin V和propidium iodide进行细胞染色）检测了早期凋亡细胞的数目(图 5A)。我们发现有mtDNA的细胞中( + cells)STP诱导的凋亡现象比在mtDNA缺乏的细胞( 0 cells)中多（图 5B），这与过去的报道一致 (9)。我们还研究了死亡受体途径。Anti-Fas 抗体 或TNF 对 0 或 + 细胞都没有预凋亡的作用。我们因此用放线菌素敏化了细胞作Fas- 和 TNF 介导的凋亡研究 (21, 22)。 Anti-Fas 抗体加放线菌素D和TNF 加放线菌素D在 0细胞中能比在 + 细胞中诱导更多的凋亡(图 5 A and B)。放线菌素 D 的孵育对 0 and + 细胞都会产生预凋亡的作用，但在凋亡细胞的比例上没有明显的差别。我们对STP、anti-Fas 抗体加 放线菌素 D 和TNF 加放线菌素 D 处理的 0 和 +细胞进行caspase 3的活性检测，结果发现在 0 和 + 细胞都有caspase 3活性明显的诱导 (图 5C)。对f 0 和 + 细胞Western blots 和免疫细胞化学染色检测发现了caspase 3的活性亚单位，证实了这些刺激物活化了caspase 3。随后，对 0 和 +细胞用相同的刺激物，我们还证实了DNA相应片断的存在(图 5D)。

图5. ⁰细胞对各种凋亡诱导信号很敏感。 ⁰(143B/206) 和 ⁰⁺(143B) 骨肉瘤细胞与0.5 µM STP, 100 ng/ml anti-Fas 抗体加100 ng/ml放线菌素 D (anti-Fas), or 20 ng/ml TNF 加 100 ng/ml 放线菌素D (TNF ) 孵育16小时。 

(A) 通过annexin V 和propidium iodide 的染色，从早期凋亡或坏死细胞(annexin positive, propidium iodide positive)中分选早期凋亡细胞(annexin positive, propidium iodide negative) 

(B)通过annexin V/propidium iodide染色得到的流式检测的早期凋亡细胞比例值与⁰(143B/206) 和⁺ (143B) 骨肉瘤细胞对凋亡诱导信号的易感度的对应*, P < 0.05. 

(C) Caspase 3 在 ⁰ (143B/206) 和⁺ (143B) 骨肉瘤细胞中的活性. 结果通过与未处理细胞的对比得到. *P < 0.05. 

(D) ⁰(143B/206) 和+ (143B) 骨肉瘤细胞中的DNA ladders

讨论
    呼吸链功能低下通过影响细胞能量的产生而产生各种病理症状，并能在各年龄段和各器官中产生征兆。脑干和胰岛的细胞缺失证实与呼吸链功能低下有关。最近我们证实了 细胞特异性的Tfam 中断导致了 细胞的缺失（23）。很明显呼吸链功能低下引起了体内的细胞缺失，但是机制却不清。

     在这篇论文里我们证实了鼠胚胎和鼠心肌中呼吸链功能低下引起的细胞程序性死亡。在两种样本中我们都发现了预示凋亡程序激活的TUNEL 阳性细胞的显著升高。随后，我们通过DNA片断的凝胶电泳证实了Tfam敲除心肌中发生的凋亡。我们在Tfam 敲除鼠胚胎中检测到了活性caspase 3，也在Tfam敲除心肌中检测到了活性caspase 3和caspase 7。Tfam 敲除鼠胚胎中呼吸链功能低下引起的主要突变显型（12）在E8.5没有引起凋亡的升高，在E9.5出现出现大规模的凋亡，在E10.5出现了胚胎的吸收。我们的研究显示缺乏mtDNA的胚胎或是分化细胞在体内都会经历凋亡。因此，对于患有mtDNA 突变疾病的患者，凋亡会是病因的一个重要因素。然而，人组织研究材料的缺乏阻碍了这种现象的进一步研究，目前仅有一篇关于人mtDNA 突变疾病使凋亡升高的报道（24）。

     ROS 通常被认为能有效地触发凋亡（25）。我们在Tfam敲除的心肌中发现了Gpx 和 Sod2转录水平的升高和Gpx 酶活性的升高。然而线粒体顺乌头酶和核编码的呼吸链复合体II ，一种活性能被ROS抑制的铁-硫酶，具有正常的活性。这暗示了一种抗氧化防御的诱导消除了ROS的产生。此外，我们没有检测到p53 的表达，据报道这是在氧压下诱导产生的（20）。ROS在呼吸链功能低下的细胞中的重要性还有许多细节需要研究，也需要在心肌以外的不同组织中开展研究。
最近有研究报道mtDNA 缺失的骨肉瘤细胞（9）或细胞色素C敲除的鼠胚胎细胞（10）的凋亡不易受STP和无血清的诱导，这结果进一步说明呼吸链功能在细胞凋亡中有非常重要的作用。因此，我们重新研究了mtDNA 缺失细胞凋亡的显型。我们的数据显示mtDNA 缺失的骨肉瘤细胞在体外能经受各种信号例如STP和死亡受体激活子诱导的凋亡。这些结果与早期缺乏mtDNA 细胞系的研究结果一致（9，26-28）。 

     细胞死亡程序，凋亡或坏死，依赖于细胞内ATP水平(29)。ATP的缺乏阻断了核的浓缩和STP或Fas诱导产生的T细胞凋亡最后阶段的DNA片段（29）。在Tfam 缺失心肌中我们没有检测到预示坏死的炎症标志或炎症后标志。这结果说明心肌在经历调亡的过程中有足够的ATP供应，尽管氧化磷酸化作用被削弱，我们发现3-磷酸甘油醛脱氢酶转录水平的升高引起了糖酵解作用的补偿性上调。这说明呼吸链功能的低下会影响线粒体膜的电压，随后可引起细胞线粒体膜通透性的变化，由此凋亡诱导因子被释放进入细胞浆。 

    先前的研究已经描述了呼吸链功能低下的细胞系凋亡的分子机制。缺乏mtDNA 的U937细胞在TNF 加放线菌酮的作用下诱导了凋亡，最初是线粒体膜电压的降低和ROS结构的增加，随后产生了DNA的断裂（28）。此外，从缺失mtDNA的U937细胞分离得到线粒体能经受由于凋亡因子的释放而引起的通透性的变化（28）。上述的结果暗示了 0细胞能诱导线粒体途径的凋亡。缺失mtDNA的骨肉瘤细胞中细胞色素介导的凋亡研究进一步地证实这种观点（27）。然而体外研究使用的突变细胞系是非整倍体的， +和 0细胞在染色体组型上存在明显的差别（30）。因此，仅通过这些研究无法证实呼吸链功能低下这一因素对不同凋亡途径易感性的影响。在缺失mtDNA 细胞中，细胞色素C介导的凋亡是否是主要的体内凋亡途径，或者是否存在其他不依赖于细胞色素C的凋亡途径，这些问题还需要进一步的研究。体内研究凋亡的方法目前还受到很多限制，迄今为止，在体外建立Tfam 敲除细胞系的多次努力也失败了。然而我们的遗传证据表明呼吸链功能的低下使细胞经历体内的凋亡 。

    呼吸链功能低下与体内凋亡升高相关的理论对于人类疾病产生了重大的影响。呼吸链功能低下已经证实在许多常见疾病（例如神经退化，心脏衰竭，真性糖尿病和衰老）的病理生理过程中扮演了重要的角色。有趣的是，在上述过程中都有细胞缺失或凋亡的发生。在恶性肿瘤和各种发生过度增生的综合症中，凋亡的减弱起了重要的作用。因此，化疗和放疗的目的在于诱导肿瘤细胞的凋亡。因此，通过调节呼吸链功能来增强或抑制凋亡对于各种疾病的治疗具有重要的作用。