前言：
细胞的能量主要来源于线粒体的呼吸链，在神经肌肉、心肌和内分泌综合症等各种病人中都发现了呼吸链功能紊乱的现象。呼吸链功能的低下在人类常见疾病中也时有发现，诸如真性糖尿病、心功能衰竭、神经退化以及正常发生的衰老过程。最近的凋亡研究进展表明线粒体在细胞程序性死亡的调节中起了关键性的作用。线粒体通过将膜上的细胞色素C释放到细胞质中诱导了凋亡的发生。在ATP的存在下，细胞浆中的细胞色素C能直接与凋亡蛋白激活因子1和CASPASE9前体反应形成凋亡小体（一种大分子的复合物）。凋亡小体能加工CASPASE9前体使之成为有活性的CASPASE9（1），从而使CASPASE3前体成为有活性的CASPASE3。另外，通过死亡受体诱导的凋亡，则是通过细胞外的配体,例如Fas配体或者肿瘤坏死因子α（TNFα）,与相应的受体结合诱导了受体的三聚作用，随后产生了衔接子，例如Fas受体相关死亡区域蛋白，TNF受体相关死亡区域蛋白和CASPASE8前体。这个复合物激活了CASPASE8前体，诱发了下游的事件，包括CASPASE3前体的激活和Bid（2,3）的分裂介导的细胞色素C的释放。线粒体和死亡受体途径都会引起CASPASE3前体的分裂，从而激活了DNase或DNA断裂因子（4-6），产生DNA片断。在凋亡的过程中。线粒体也释放其他蛋白，例如凋亡诱导因子，该因子本身并不激活CASPASE，但能直接地转位到细胞核，诱导产生DNA片断（7）。而另一个来源于线粒体的CASPASE蛋白激活子能阻断凋亡蛋白的抑制因子（8）。目前还不清楚呼吸链的功能低下是否能影响体内凋亡的诱导。缺乏mtDNA 的人细胞系( 0 cells)能抗拒STP(staurosporine )诱导的体外凋亡的现象暗示着呼吸链功能对于凋亡是必要的（9）。敲除了细胞色素C基因的小鼠细胞，不能诱导产生线粒体途径的凋亡，但对死亡受体诱导的凋亡更为敏感（10）。这种原因可归结为线粒体内可释放的细胞色素C的缺乏，呼吸链功能低下，或这两种因素综合作用的结果。在本论文中，我们研究了因Tfam 缺失而导致呼吸链功能低下的鼠胚胎和鼠心肌中的凋亡。我们还研究了缺乏mtDNA 的人细胞系抗凋亡的能力。
材料和方法
样本组织
来自2-3周心肌Tfam 缺失小鼠(TfamloxP/TfamloxP,
+/Ckmm-cre)(11)的心肌样本和同窝出生对照小鼠的心肌样本。纯合的Tfam 敲除小鼠胚胎(Tfam-/-)来自于杂合的Tfam 敲除小鼠(Tfam+/-)交配所得（12）。样本直接包埋在OCT
Tissue-Tek (Sakura, Zoetenwoude, The Netherlands)中，置于－70°C 下。
细胞系.
人骨肉瘤来源的细胞系，
143B, 包括了 mtDNA (
+), 和mtDNA-less , 143B/206 (
0) (13), 培养在 DMEM高糖培养液中 (1000 mg/liter;
GIBCO/BRL, Life Technologies, Täby, Sweden) ，10% FBS 和 100 IU/ml 双抗(GIBCO/BRL, Life Technologies). 143B/206
0 细胞的培养液中还加入了1mM 丙酮酸钠
(GIBCO/BRL, Life Technologies) 和 50 µg/ml 尿嘧啶核苷 (Sigma-Aldrich)（13）。
细胞毒性化验.
细胞37°C培养在以下条件16小时：(i) 0.5 µM STP (Sigma-Aldrich); (ii) 100
ng/ml 人 anti-Fas 抗体 (MBL, Nagoya, Japan) 加上 100 ng/ml 放线菌素D (Sigma-Aldrich); (iii) 20
ng/ml 人 重组 TNF (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) 加上100
ng/ml放线菌素D。在TNF 加放线菌D 或 anti-Fas抗体加放线菌素D前，细胞用100
ng/ml 放线菌素D37°C预处理15 分钟。
凋亡细胞的流式细胞分析.
用Vybrant 凋亡检测试剂盒2 (Molecular Probes)染色细胞。使用Becton Dickinson 流式细胞仪(FACScan)进行流式细胞的检测，结果用CELL QUEST 程序进行分析(Becton Dickinson)。凋亡试剂盒用于
0 and
+ 细胞的检测。这两种细胞均与0.5 µM STP (n = 3), 100
ng/ml人anti-Fas抗体加100 ng/ml放线菌素D (n = 4), 以及20 ng/ml 人重组TNF 加100
ng/ml放线菌素D (n = 4)孵育16小时。
脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP 刻痕末端标记（TUNEL）检测
低温保存的心肌或胚胎组织切片以及组织培养细胞切片用1％的多聚甲醛-PBS室温固定10分钟。使用Apoptag Peroxidase试剂盒(Invitrogen)进行TUNEL染色。使用Methyl Green
(Dako)进行复染。心肌切片部分使用NIH IMAGE 1.41程序(http://rsb.info.nih.gov/nih-image) 进行分析。 在整张切片上计数TUNEL阳性细胞，通过每平方毫米TUNEL阳性细胞数建立凋亡指标。TUNEL 染色用于2-3周心肌Tfam 敲除小鼠（n = 15）的心肌切片和同窝出生的对照小鼠（n = 15），以及Tfam 敲除小鼠胚胎(Tfam-/-)和同窝出生的对照胚胎（E8.5 (n = 3)，E9.5 (n = 4)）
DNA 凝胶电泳检测.
组织和细胞在lysis buffer (50 mM Tris·HCl (pH 8.0)/0.1 M
NaCl/2.5 mM EDTA/0.5% SDS/200 µg/ml proteinase K)中50°C孵育3小时。 DNA经氯仿抽提后，1 µg/ml
DNase-free RNase (Roche Molecular Biochemicals)室温处理1小时。DNA样本(10-20 µg)通过1.8%琼脂糖凝胶电泳进行分离。凝胶用SYBR Green I nucleic acid gel stain (Molecular Probes) 进行染色，并在紫外光下进行观察。
Caspase 3活性的检测.
使用caspase 3检测试剂盒(PharMingen)检测Caspase 3的活性。简单地说，把标记了荧光素的四肽（7-氨基-4-甲基香豆素）作为caspase 3活性鉴定和计数的底物。7-氨基-4-甲基香豆素来源于caspase-3分裂时酶作用的底物。在紫外光（激发光365 nm，发散光460 nm）下，可对游离的7-氨基-4-甲基香豆素进行量化。荧光计数利用表面浓缩的蛋白进行标准化检测。Caspase 3 活性分别在
0 and
+ cells中进行检测，两种细胞分别在0.5 µM STP (n = 3), 100
ng/ml 人 anti-Fas 抗体 加 100 ng/ml放线菌素D (n = 3), 以及20 ng/ml human重组 TNF 加100
ng/ml 放线菌素D (n = 3) 中孵育16小时。
Northern Blot. 心肌样本的RNA通过Trizol Reagent (GIBCO/BRL, Life Technologies)进行分离。RT-PCR产物经凝胶电泳分离后，使用QIAEX II 胶抽提试剂盒进行纯化(Qiagen, Germany), 用 -32P进行放射性标记后，作为探针去检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶，心房利钠因子，肌浆网Ca2+ ATPase2，Bcl-x(L)，Bax ，谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx), 和线粒体超氧化歧化酶 (Sod2) 转录子。信号的强度通过FUJIX Bio-Imaging Analyzer BAS 1000 (Fuji)记录, 并利用IMAGE GAUGE V3.3程序 (Fuji)进行数据分析。以18S rRNA作为对照标准。
组化和生化指标.
低温保存的心肌或胚胎组织切片以及组织培养细胞切片用1％的多聚甲醛-磷酸缓冲液室温固定10分钟后，用冰醋酸或冰乙醇浸泡5分钟。采用多克隆抗血清与下列蛋白反应
(i) 剪切后的 caspase 3 (cell signaling technology; New England Biolabs); (ii)剪切后的 caspase 7 (cell signaling technology; New England
Biolabs); (iii) p53 (Santa Cruz Biotechnology).将一抗与切片在相应的稀释液中4°C孵育过夜，用Dako Envision TM
(Dako)作为二抗。免疫组织化学染色检测在敲除Tfam 的心肌切片(n = 4-7)及相应的对照片(n = 4-7)和E9.5 Tfam 敲除胚胎(n = 4)及相应的对照胚胎切片(n = 4)中的caspase 3 和7。同样也检测在敲除Tfam 的心肌切片(n = 3)及相应的对照片(n =3)中的p53。酶组织化学染色则检测上述的样本切片中细胞色素C氧化酶和琥珀酸脱氢酶的活性（12）。酶活性的生物化学检测则对上述敲除Tfam 的心肌切片(n = 8)及相应的对照片(n = 8)进行检测（14，15）
Western Blots.
准备总蛋白的抽提物，并根据上述方法进行Western blots（11）。将一抗与p53 (Santa Cruz Biotechnology), 剪切后 caspase 3
(Cell Signaling Technology; New England Biolabs), 和蛋白激酶C的 异构体(Santa Cruz Biotechnology)反应。
结果（转下页）