蛋白质组学和蛋白质分析

图2 DeCyder 差异分析软件输出显示了具有CyDye DIGECy3饱和标记荧光染料标记的内标(左上部)和CyDye DIGE Cy5饱和标记荧光染料标记的野生型(右上部)的参考凝胶图像。放大的盒框区(右下部)和粉红色区域的3-D图形(左下部)被显示。

数据被过滤,仅仅包括Student's T-testp ≤ 0.0005的蛋白点。与野生型相比较,在转基因样品中有61个蛋白点显示出标准化的体积增加幅度超过10%,并且67个蛋白点的体积减少幅度超过10%

    为了确认质谱分析身份能够从CyDye DIGE Fluor饱和染料标记的样品产生,覆盖等电点和分子量范围的10个凝胶块被从制备型凝胶切割,并进行胰蛋白酶消化。蛋白质通过数据库搜索从它们的肽质量指纹图谱(PMF)被鉴定(数据显示在表2)。继续在这个模式系统中进行处理,因此蛋白质功能代替了单个蛋白质的身份。

    这儿鉴定的蛋白质参与了正常的细胞功能,例如能量代谢和突触功能、以及氧化胁迫和蛋白质降解路径等病理事件、所有已知在AD病人大脑中受影响的过程。被鉴定的两个蛋白质与正常氧化代谢产生的活性氧物质的代谢有关。这些氧化剂的产生导致的氧化胁迫在包括AD在内的神经衰退性疾病中是一个共同的特征(AD),APP转基因型中发现的改变的表达与这个结果相一致。另一个被鉴定的蛋白质与蛋白质的细胞降解相关,此系统已知在AD中受影响,并且可能产生这个疾病特有的β-淀粉样沉积。程序性细胞死亡最近已被暗示在AD和其它神经衰退性疾病中发挥作用,并且一些蛋白质已知是被β-淀粉样沉积介导的细胞死亡诱导产生的。这个例子中通过蛋白质组分析发现的这些蛋白质因此与这些改变相一致。

结 论

    使用CyDye DIGE Fluor饱和染料的双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)已经被用于少量材料的蛋白质组研究。这个研究说明了CyDye DIGE Fluor饱和染料和DeCyder

 

异分析软件对于来自非常有限量样品(例如LCM样品)的蛋白质差异的完全2-D分析和鉴定的价值。表明CyDye DIGE Fluor饱和染料标记的样品与随后的质谱分析相兼容的数据也已被描述。

    使用这个系统,在人APP参与的神经衰退性疾病发展中的潜在重要蛋白质以高水平的统计学可信度被检测出。与LCM相结合,DIGE的应用因此允许对相对容易获得的少量样品进行蛋白质组研究,而且也允许分析各个领域的其它稀有样品。

表2. 基于DeCyder差异分析软件得到的数据而选取的蛋白点的结果总结。蛋白质随后通过Ettan MALDI-ToF Pro产生的PMF图谱而被鉴定。
蛋白质号码 蛋白质功能 平均比率 T-检验
3356 代谢 1.31 2.7 × 10-5
2947 与凋亡相关 1.37 4.5 × 10-8
3504 氧化胁迫 1.26 2.9 × 10-5
3526 氧化胁迫 1.27 1.9 × 10-5
999 蛋白质代谢 -1.15 5.0 × 10-5
3370 突触活性 1.25 3.9 × 10-4
3804 突触活性 1.16 2.5 × 10-4
1476 胞质骨架 -1.39 1.6 × 10-5
1492 胞质骨架
-1.49
4.5 × 10-7
347 突触活性
-1.44
2.7 × 10-4
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