蛋白质组学和蛋白质分析
Deep purple全蛋白质染色与Ettan DIGE系统和MALDI-ToF质谱分析的兼容性

简 介
    使用EttanTM DIGEFluorescence Difference Gel Electrophoresis[1-4])系统的双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)是一个已经建立的方法,它在差异分析的双向电泳之前用CyDyeTM DIGE荧光物质预先标记蛋白质样品。Ettan DIGE系统包括CyDyeTM DIGE荧光染料、TyphoonTM 9400可变模式成像仪(Variable Mode Imager)和DeCyderTM 差异分析软件(Differential Analysis Software)。
    Ettan DIGE系统中当前可用的三种CyDye DIGE荧光染料每一种光谱上都可分辨,并且与数量和电荷相匹配,它允许在相同的2-D凝胶上分析最多三种分开的蛋白质混合物。一般地,这个系统被应用于分析型凝胶。在分析型凝胶中此系统能够掺入应用于每一张2-D凝胶的内标,从而产生蛋白质丰度的更准确的统计学分析。每一个样品都与相同的凝胶内标准相比较,以致当多个样品在凝胶之间比较时,每一个样品都相对于此标准而被测量,从而减少了凝胶之间变化引起的效应并且增加了统计学上的可信度。然后,使用总蛋白质染色方法染过的制备型凝胶与此数据套进行匹配,从而创建了感兴趣蛋白质的一个切割列表,供质谱仪进一步分析。
    这里我们在研究人乳腺细胞系HBL-100和人原位性乳腺癌BT-474之间差异的模式系统中,评价了深紫总蛋白质染色(Deep PurpleTM Total Protein Stain [5,6])与Ettan DIGE系统和使用Ettan MALDI-ToF Pro的质谱分析的兼容性。

使用到的安玛西亚公司产品的订货信息
货号
说明
80-6414-02
Ettan IPGphor IEF system
80-6466-27
Ettan DALTtwelve Large Vertical Electrophoresis System
80-6467-22
DALT Gel Caster
63-0038-55
Typhoon 9410 Variable Mode Imager & ImageQuant(tm) Image Analysis Software
RPN 6305
Deep Purple Total Protein Stain
17-0456-01
Pharmalyte 3-10 for IEF
17-1330-01
PlusOne Bind-Silane
17-6002-45
Immobiline DryStrip pH 3-10 NL, 24 cm
17-1335-01
Immobiline DryStrip Cover Fluid
RPK 0272
CyDye DIGE Fluor, Cy2 minimal dye
RPK 0273
CyDye DIGE Fluor, Cy3 minimal dye
RPK 0275
CyDye DIGE Fluor, Cy5 minimal dye
 

方  法
分析型凝胶的样品标记

    细胞裂解物通过超声波降解法准备,所依据的标准方法(7)中的裂解缓冲液包含5 mM乙酸镁、7 M尿素、2 M硫脲、4% (w/v) CHAPS30 mM TrispH 8。为了获得关于正常乳腺细胞和乳腺癌细胞之间差异的统计学上有效的数据,等量(25 μg)的正常乳腺细胞和乳腺癌细胞的蛋白质裂解物被混合,并被指定为合并的内标。充足量的标准样品使用最小限度的CyDye DIGE Fluor CyTM 2染料大批标记,以便包括应用于每一张凝胶的标准。来自正常和癌细胞裂解物的蛋白质(50 μg)分别使用CyDye DIGE Fluor Cy3Cy5染料标记。这些蛋白质被大批标记,它们的量对于表1中实验设计显示的所要求的凝胶数目是充足的。

表1 为生物学的差异分析而使用的2-D DIGE实验设计

凝胶号码 内标 组1 组2
Gel 1
合并的标准Cy2
正常Cy3 疾病Cy5
Gel 2 合并的标准Cy2 正常Cy3
疾病Cy5
Gel 3
合并的标准Cy2
正常Cy3
疾病Cy5
Gel 4
合并的标准Cy2
正常Cy3
疾病Cy5
Gel 5
合并的标准Cy2
疾病Cy3
正常Cy5
Gel 6
合并的标准Cy2
疾病Cy3
正常Cy5
Gel 7
合并的标准Cy2
疾病Cy3
正常Cy5
Gel 8
合并的标准Cy2
疾病Cy3
正常Cy5

    CyDye DIGE Fluor最小量标记荧光染料,蛋白质裂解物按照标准的方法被标记(3)。7 M urea2 M thiourea4% (w/v) CHAPS30 mM TrispH 8.5溶液中50 μg试样量的蛋白质裂解物黑暗环境下使用400 pmol最小限度的CyDye DIGE Fluor染料在冰上最小限度地被标记30分钟。与染料等体积的赖氨酸(10 mM)被加到反应液中,黑暗环境下进一步冰上孵育10分钟。标记反应通过往每一个被标记蛋白质样品加入等体积的包含7 M urea2 M thiourea4% (w/v) CHAPS2 mg/ml DTT2% (v/v) PharmalyteTM 3-10样品缓冲液而终止标记反应。

电泳分离
    在等电聚焦(IEF)之前,标记好的样品按照表1描述的方法混合。使用这一方法后,每一张凝胶包含Cy2标记的标准和Cy3Cy4标记的单个的样品。

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