等电聚焦使用Ettan IPGphor Manifold仪器在Ettan
IPGphorTM 电泳系统进行。第二向电泳使用Ettan
DALT twe/ve电泳系统而实现。
分析型凝胶的成像和分析
分析使用的凝胶图像通过Typhoon
9400可变模式成像仪获得，此成像仪被设计用来光学检测最小限度的CyDye
DIGE Fluor染料，使用的设置如下：Cy2（488
nm激发激光和520BP40发射过滤器）；Cy3（532
nm激发激光和580BP30发射过滤器）和Cy5（633
nm激发激光和670BP30发射过滤器）。
产生的图像使用DeCyder差异分析软件5.0版本来处理。凝胶上的蛋白点自动地被共同检测作为2-D
DIGE图像成对，此成对本质地连接一个样品到它的胶内标准。凝胶之间的匹配使用来自每一图像成对的胶内标准而实现。样品之间的实验创建和关系在DeCyder软件被分配。每一张Cy3或Cy5凝胶图像被分配为实验条件组1（正常）和组2（疾病）。所有Cy2图像被分配为标准。拥有最多蛋白点数量的凝胶自动地被指派为总凝胶。对每一个匹配的蛋白点套执行Student's
T-test，它为正常和疾病组之间的一个给定蛋白点比较蛋白质丰度的平均数和标准方差。蛋白点经过软件过滤后就仅仅包括在切割列表中的蛋白质，这些蛋白质在丰度上表现为显著的改变（p
= 0.0005）。
“深紫”蛋白质染色
使用“深紫”总蛋白质染色方法进行凝胶染色是根据标准的方法实现的。所有步骤都在摇动的平台上于室温完成。凝胶首先放在固定溶液（7.5%
[v/v] 乙酸、10% [v/v] 甲醇）中过夜，接着用水漂洗4
× 10 分钟，凝胶在“深紫”染液（用水按1：200稀释而配制成）中孵育并轻微搅动1小时。染色的发展在浓氨水的1：1000稀释溶液中孵育3
× 10分钟而实现。然后，在玻璃板上扫描成像之前，凝胶在信号稳定溶液（0.75%
[v/v] 冰乙酸）中漂洗至少10分钟，Typhoon
9410可变模式成像仪被用来收集“深紫”染色的图像。对于标准的1-D和2-D凝胶，532
nm激光被用于激发，使用560LP发射过滤器。在CyDye预先标记的、使用“深紫”染色后的分析型凝胶的扫描过程中，使用的扫描参数是457
nm激光激发，结合610BP发射过滤器以避免Cy2和Cy3信号的交叉影响。凝胶4°C保存在信号稳定溶液中。
质谱分析和蛋白质点鉴定
为了质谱分析，制备型凝胶电泳的样品为包括各自250 μg未标记的HBL-100和BT-474裂解物的混合物（总共 |
|
500
μg）。双向电泳完成后，制备型凝胶按照标准的步骤用“深紫”染色。此图像使用DeCyder软件自动地与分析型凝胶匹配套中的总凝胶图像相匹配。一个蛋白点切割列表从DeCyder软件中产生并输出到Ettan斑点切取系统。凝胶蛋白点被切割成2-mm直径凝胶块并且转到96-孔板中。
在使用50 mM碳酸氢铵漂洗凝胶块两次、然后用含50%
(v/v)乙腈的50 mM碳酸氢铵脱色、接着用100%
(v/v) 乙腈脱水之后，进行胶内酶解。使用含500 ng胰蛋白酶(Promega，USA)的50
mM碳酸氢铵（pH 8）室温酶解过夜后，肽段依次使用1%
(v/v)三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）的水溶液、含50%(v/v)乙腈的0.2%
TFA水溶液而被抽提，冻干以后，先用ZipTipTM
C18把肽段洗涤干净，然后肽段重新悬浮在10 μl的0.1%
TFA水溶液中。Tip头用50%乙腈洗涤三次而再水化、用0.1%
TFA水溶液洗涤三次而平衡后，吸入肽段溶液十次以确保结合。包含肽段的tip头用0.1%
TFA的水溶液洗涤三次，接着使用3 μl 的50%乙腈/0.2%
TFA水溶液把肽段洗脱下来。
肽质量指纹图谱使用Ettan MALDI-ToF
Pro生产商推荐的方法（8）而获得。MALDI产生的质量图谱使用胰蛋白酶峰而被内在校准。肽段质量用来在ProFoundTM
软件中（10）搜索美国国家生物技术信息中心（NCBI）的非冗余的哺乳动物数据库（9），并且使用来自Matrixscience（11）的一个Mascot
search和来自MS-Fit （12）的SwissProt数据库而确认。每一个肽段中一个丢失的切点是允许的，并且在所有的搜索中使用100
ppm的起始质量容许值。甲硫氨酸的局部氧化被假定。
结果和讨论
在制备型凝胶分析中“深紫”的使用
一组典型的分析型2-D DIGE实验被实现，并且CyDye标记的蛋白质样品根据它们相应的光谱而被成像（图1）。
一块制备型凝胶也被电泳和使用“深紫”染色（图2a），所有的凝胶图像使用DeCyder软件而被匹配，此软件给所有确认的蛋白点分配一个单个的蛋白点编号。许多蛋白质显示出在“正常”和“疾病”样品之间具有显著的改变，并且这些蛋白质的选集被挑选出（图2b）。
由30个被切割的蛋白点中的10个组成的有代表性的样品被进一步处理，以便评价“深紫”总蛋白质染色和质谱分析的兼容性。这10个凝胶块中的8个通过Ettan
MALDI-ToF Pro的肽质量指纹图谱肯定地被鉴定。“深紫”总蛋白质染色不干扰质谱分析的判断是明显的。在两个被举例说明的图谱中（图3），可以观察到贯穿图谱的全过程的背景信号很低， |