蛋白质组学和蛋白质分析
用化学辅助片段化MALDI(CAF-MALDI)提高差异蛋白的鉴定率
Lena Homsten 1  John Prime2   and Maria Liminga1
1
Amersham Biosciences, Bjorkgatan 30,751 84 Uppsala Sweden,2Amersham Biosciences, The Grove Centre,White Lion Road.
Amersham,Buckinghamshire,HP79LL.UK  

简介

     本篇介绍了蛋白相对定量和用MALDI进行蛋白鉴定的方法。操作流程包括:选取双向荧光差异凝胶电泳(DIGE)的差异点,通过肽质量指纹谱图(PMF)结合化学辅助片段化MALDI(CAF-MALDI)进行蛋白鉴定。该方法的优势是在蛋白鉴定前首先选取感兴趣的蛋白点,这样可以减少分析量,并给MS测定提供了快速经济的方法。

方法
     先用20mM的安息香酸处E.coli, strain ER1647, 37℃下处理60分钟,再用0.0025%甲硫氨酸在37℃下处理60分钟。处理过的与对照的样品均用CyDyeTM DIGE荧光染料标记,然后混合样品,用双向电泳分离(3个平行胶,每根胶条子50ug样品,IPG strip pH 4-7)。用DeCyderTM 差异分析软件对3块胶进行图像分析,选取表达量有差异的蛋白。在Sypro Rudy染色的制备2D胶上(上样量力500ul),切取表达量增加或降低的蛋白点(共54个蛋白点),进行胰蛋白酶消化和酶解肽片段提取。取十分之一的样品测定MALDI肽质量指纹谱图,选用的基质为a-氰基苯乙烯酸。对于用PMF无法鉴定的蛋白可以用EttanTM CAFTM MALDI测序试剂盒修饰,进行PSD-MALDI分析。

  化学辅助片段化MALDI

原理:

    在胰蛋白酶酶解的肽段的N端引入一带负电的基团,由此得到下述的断裂碎片


来自E.coli的caperon Dnak蛋白的酶解肽段用CAF-MALDI试剂盒修饰,样品由反射场MALDI分析,四个被修饰后的肽段被选择用于PSD分析,然后进行自动PSD鉴定,结果参见PSD谱图1-4。
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