简介

     本篇介绍了蛋白相对定量和用MALDI进行蛋白鉴定的方法。操作流程包括：选取双向荧光差异凝胶电泳（DIGE）的差异点，通过肽质量指纹谱图（PMF）结合化学辅助片段化MALDI（CAF-MALDI）进行蛋白鉴定。该方法的优势是在蛋白鉴定前首先选取感兴趣的蛋白点，这样可以减少分析量，并给MS测定提供了快速经济的方法。

方法
     先用20mM的安息香酸处E.coli, strain ER1647, 37℃下处理60分钟，再用0.0025%甲硫氨酸在37℃下处理60分钟。处理过的与对照的样品均用CyDye^TM DIGE荧光染料标记，然后混合样品，用双向电泳分离（3个平行胶，每根胶条子50ug样品，IPG strip pH 4-7）。用DeCyder^TM 差异分析软件对3块胶进行图像分析，选取表达量有差异的蛋白。在Sypro Rudy染色的制备2D胶上（上样量力500ul），切取表达量增加或降低的蛋白点（共54个蛋白点），进行胰蛋白酶消化和酶解肽片段提取。取十分之一的样品测定MALDI肽质量指纹谱图，选用的基质为a-氰基苯乙烯酸。对于用PMF无法鉴定的蛋白可以用Ettan^TM CAF^TM MALDI测序试剂盒修饰，进行PSD-MALDI分析。

    在胰蛋白酶酶解的肽段的N端引入一带负电的基团，由此得到下述的断裂碎片