蛋白质组学和蛋白质分析
肽的化学辅助片段化的ESI-MS/MS测定
H. Wadensten1, L. Hornsten1, G. Woffendin2, S. Renlund1, and D. Fenyo1
1Amersham Biosciences and 2Thermo Electron

简 介
    串联质谱常被用于蛋白测序及详细定性研究。研究者通常优化实验条件使得每个肽只有单一的断裂位点,从而产生两类肽片段。在许多情况下两类肽片段都会带上电荷,使得谱图同时出现N端和C端的肽片段峰,使片段解析复杂化。
    本文描述了如何应用N端修饰简化电喷雾片段谱图,使得得到的谱图可以轻松解析并获取所需信息。


原 理
    主链氨基氮原子的质子化能降低肽链的键能,使得肽链得以在低能条件下断裂。双质子的胰蛋白酶酶解肽段用于质谱测序很理想,因为第二个质子很容易使主链氨基的氮原子离子化,从而导致肽链断裂。
在N端引入一个带负电的基团可得到双质子化而净电荷为1的肽链,可提高断裂几率。而断裂产生的b-片段离子因为电中性而不被检测,因此可得到单纯的y-片段离子并使谱图解析变得容易。

材料与方法
    混合蛋白样品被还原、羧甲基化并用修饰的胰蛋白酶水解。酶解后的肽段用EttanTM CAFTM MALDI 测序试剂盒进行化学修饰,通过用磺酸硫氨酯对肽链的修饰提高片段化效率,然后用毛细管LC-MS/MS (LCQTM DecaXP)进行分析,LC分离采用BiobasicTM C18, 180(m I.D. x 100mm 柱子,流动相为0.1% 的蚁酸水溶液(A)和0.1% 的蚁酸乙腈溶液(B)。采用的流速为 2(l/min。

结 果
胰蛋白酶酶解肽段

  纤维蛋白原肽A的MS/MS谱图:

 

(ADSGEGDFLAEGGGVR):
     a) 双质子化的未修饰的肽段的MS/MS谱图。
     b) 带单电荷的经磺酸硫氨酯修饰的肽段的MS/MS谱图,因为碎片段主要为肽链的C端(y-片段离子),简化了谱图解析。

胰蛋白酶酶解肽段(续)

    单电荷的磺酸硫氨酯修饰的胰蛋白酶酶解肽段的MS/MS谱图:

    a) ALELFR, b) VEADIAGHGQEVLIR, c) HGTVVLTALGGILK, d) LCVLHEKC端带有精氨酸或赖氨酸的肽段经修饰后的断裂情况很好,MS/MS谱图主要为谱图主要为y-片段离子。

带有脯氨酸的胰蛋白酶酶解肽段
    单电荷的磺酸硫氨酯修饰的带有脯氨酸的胰蛋白酶酶解肽段的MS/MS谱图:
    a) LFTGHPETLEK, b) IPIK。带有脯氨酸的肽段通常在脯氨酸的C端断裂效率不高。

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