实验方法
◆ 通过固定了CBD的传感表面从牛脑粗提液中俘获钙调素
◆ 回收结合在传感片表面的物质
◆ 通过质谱鉴定回收到的蛋白质

俘获和回收
    将10mg牛脑干粉与1mlHBS缓冲液（10 mM Hepes,150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 , pH 7.4. ）充分混匀，然后离心去不溶杂质。用HBS缓冲液将上清液稀释10倍体积，取200ul加到固定了CBD的传感片表面的4个通道（进样流速为20ul/min）。液体传送系统接着用50mMNaOH冲洗，传感片表面用50 mM NH4 HCO3 , 2 mM CaCl2漂洗。回收到的物质总量为4600RU，相当于4.6ng或275fMol钙调素。

      图3 全钙调素谱图

MALDI-TOF质谱分析完整的蛋白质
    结合在传感片表面的物质用0.5%TFA回收后，被点到Bruker Daltoniks MALDI靶并覆上一薄层肉桂酸HCCA基质和硝化纤维。在谱图上只有带一价正电和二价正电的两个峰(图3)。

原位酶切，蛋白质肽质量指纹谱图

    在这个实验中，钙调素用上述方法回收，但回收液用50 mM NH4 HCO3 , 2 mM EGTA。然后点到Bruker Daltoniks AnchorChip(tm)靶上（0.8ul每点）。再加1ul15ug/ml的胰蛋白酶，风干后在加1ul0.5%TFA和1ul0.5mg/ml肉桂酸（溶于乙醇：丙酮2：1）再风干。这些操作都由Biacore 3000自动进针根据用户设定的方法完成。质谱记录的谱图和肽质量被递交到Mascot数据库中检索(Matrix Science)。经过检索95%的氨基酸序列能匹配，因此该蛋白质被鉴定为钙调素。其中的两个肽片段（1564和2400）的翻译后修饰并与一组已知的翻译后修饰的钙调素质量比较(图5)。

图5 从配体垂钓实验中获得的两个胰酶消化肽段的MALDI MS/MS谱图相当于钙调素氨基酸序列107-126（A）和1-30（B）的肽片段。阴影部分指出114赖氨酸和1丙胺酸经过修饰后的质量差异。

用MS/MS进行肽片段测序和翻译后修饰的鉴定

     图6显示了Ultraflex MALDI-ToF/ToF质谱得到的质量为2401.1和3389.7的肽片段的谱图。除了全部序列以外，两种修饰也被检测到。前一个与牛脑钙调素的114赖氨酸相对应的肽片段中的赖氨酸是三甲基化或已酰化了（这两种修饰增加的质量是一致的），后一个肽中的丙胺酸被甲基化了。这与以知的牛脑钙调素的114赖氨酸三甲基化和丙胺酸甲基化的情况是基本符合的。

图6 用LC/MS/MS技术得到的钙调素序列用红色表示的部分是从配体垂钓实验获得的物质的序列。

    在另一个平行实验中，同样把结合在传感片表面的物质回收以后用胰酶消化。消化液用LC/MS/MS技术Esquire 3000plus ESI质谱分析。被明确地鉴定为牛脑钙调素，Mowse分值达253。获得了包括翻译后修饰在内的涵盖了55%的钙调素序列的10个肽的氨基酸序列。

结 论
    SPR-MS技术可以被作为解决蛋白质组研究中的典型问题------识别蛋白质功能相关伙伴分子的方法。
    Biacore 3000提供了全自动的工作流程包括配体结合，回收，可选的原位酶切，并为MALDI-TOF MS，MALDI-TOF/TOF MS/MS，和LC/ESI MS/MS准备样品。