蛋白质组学和蛋白质分析
2-D DIGE在小分子抗肿瘤药物作用机制研究中的应用
Y. Oda*, T. Owa*, T. Sato*, H.Yamanaka+,Y. Shinohara+, A.Yokoi*, J. Kuromitsu*, T. Nagasu*, and A. Alba+
*Eisai Co., Ltd. Laboratory of Seeds Finding Technology, Tokyo, Japan; +Amersham Biosciences KK, Tokyo, Japan;
+Amersham Biosciences, Grove Centre, Amersham, Buckinghamshire, UK

在本研究中, 2-D DIGE(荧光差异凝胶电泳)结合EttanTM DIGE系统被用来研究小药物分子E7070的作用机制。相互作用分子通过E7070亲和层析分离,并与没有活性的E7070类似物亲和柱洗脱下来的蛋白质相比较。2-D DIGE检测出的、在E7070洗脱液中增加的蛋白点通过质谱分析鉴定。那些特异地与E7070相互作用的蛋白质很可能参与了它的抗肿瘤活性。

简 介
    尽管抗肿瘤试剂E7070的作用机制现在还未知,但是已经知道它在G1期可以封闭细胞周期。为了获得此试剂生物活性的知识,采用E7070亲和层析从人结肠癌细胞系HCT116的细胞裂解物中分离相互作用分子。
    为了给非特异结合设置对照,携带没有活性的E7070类似物E7070*的亲和层析平行地进行操作。E7070和E7070*的结构如图1所示。

 
物被上样到1ml柱床体积的每一种亲和基质中,接着使用含有0.05% CHAPS的25mlPBS洗涤。蛋白质在6M盐酸胍和2% CHAPS溶液中被洗脱,然后在10 mM碳酸氢铵溶液中透析。洗脱下来的蛋白质真空抽干,然后溶解在裂解缓冲液(8 M urea、4% w/v CHAPS、30 mM Tris, pH 8.5)中。

图2. 实验流程。混合的内标包括等量的每一种洗脱液。对于差异分析而言,得到内标与样品蛋白点的体积比率并且在不同凝胶之间被比较,接着计算Student´s-test。
图1. 活性化合物(A)E7070和没有活性的化合物(B)E7070*的结构。

      两个层析柱洗脱液使用2-D DIGE进行比较,从而鉴定出与没有活性的层析柱相比、在活性层析柱富集的蛋白质。在活性样品中显著增加的蛋白点被切割下来并用质谱鉴定。实验流程如图2所示。
    2-D DIGE是用于比较蛋白质组学研究的技术。这种方法包括使用电荷和大小匹配的CyDyeTM DIGE荧光物质预先标记不同的蛋白质样品,然后这些样品混合起来并在相同的2-D凝胶上分离。荧光染料的特性确保了产生的凝胶图像将完美地重叠。内部标准包括在每一张凝胶中。
    DeCyderTM 差异分析软件(Differential Analysis Software)中新颖的运算法则允许内部标准信号使用相同凝胶上的样品信号而被共检测。这有效地去除了系统误差,从而能够对样品之间的真实蛋白质差异进行正确定量(1)。

材料和方法

样品准备

    每一种化合物通过苄胺连接在碱性pH环境下被耦连到亲和基质上,以致被固定的化合物的量在每一情形下大约为8mg/ml湿凝胶。来自3.5 × 108 HCT116细胞的细胞裂解

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