标记和2-D电泳
    混合的内标包括等量的每一种样品。蛋白质样品按以前描述的方法（2）使用最小限度的CyDye DIGE Fluor染料标记。要在同一张凝胶上分离的样品混合在一起，然后加入等体积的2×样品缓冲液（8 M urea, 4% [w/v] CHAPS, 130 mM DTT, 2% [v/v] Pharmalyte^TM pH 3-10）。

    然后样品通过杯型上样被加到水化的24-cm Immobiline^TM DryStrip干胶条pH3-10中，接着在Multiphor^TM Electrophoresis System进行IEF共60 kVh。聚焦好的胶条在6 M urea、30% glycerol、1% SDS、50 mM Tris pH 8.8、65 mM DTT中平衡10 min，然后在6 M urea、30% glycerol、1% SDS、50 mM Tris pH 8.8、240 mM碘乙酰铵中平衡10 min。
    第二向分离在Ettan DALTtwelve Gel Caster和低荧光玻璃板准备的12.5%均一胶（26×20 cm）上进行。电泳使用Ettan DALTtwelve Electrophoresis System在2 W/gel、15℃条件下实现，直到蓝色染料前沿跑出凝胶的底端。

图像抓取和分析
   SDS-PAGE完成后，凝胶仍然在玻璃板内部时被扫描。凝胶成像使用Typhoon^TM 9410 Variable Mode Imager在100 μm分辨率下进行。
   图像分析使用DeCyder差异分析软件在一种自动的模式上完成。来自不同凝胶的蛋白点模式使用内部标准样品存在于每一张凝胶上而被匹配，从而允许蛋白点—体积比率的比较和统计学分析。Student's-test被用来鉴定在活性层析柱的洗脱液中显著增加的蛋白点。

蛋白点切割和消化
   Decyder差异分析软件产生的切割列表被传输到Ettan Spot Picker，供自动的蛋白点切割。凝胶块被存放到96-孔微型板，并且使用胰蛋白酶进行胶内酶解（3）。

质谱分析
   HPLC在150 mm×0.1 mm C18毛细管柱上进行，洗脱液直接进入LCQ^TM ESI 离子阱质谱仪 (Thermo Finnigan公司)或者QSTAR^TM pulsar I ESI QqTOF质谱仪(Applied Biosystems公司)。MS-MS图谱在数据依赖的模式中获得，在此模式中每一次MS扫描中的最高强度峰被选择用于碰撞诱导的解离。MS-MS数据通过Mascot(tm) (4) (Matrix Sciences)和Sonar(tm) MS-MS (Genomic Solutions)而被分析。

结果和讨论
   对于2-D DIGE分析而言，混合的内标含有等量的从E7070和E7070^*层析柱洗脱下来的蛋白质。混合的内标包括在实验中的每一张凝胶中。体积-比率测量在同一块凝胶中的混合的内标和样品之间进行计算，这些比率在多张凝胶之间被比较。这有效地去除了系统误差，从而增强了样品之间蛋白质差异分析的准确性，并且可对E7070和E7070^*层析柱之间蛋白质差异进行灵敏和正确的定量。
   在使用DeCyder差异分析软件分析后，数据组通过蛋白点平均体积比率的Student's-test-被过滤，保留了在E7070洗脱液中丰度显著地更高的蛋白点。这些蛋白点被切割和通过质谱分析被鉴定。

      DeCyder差异分析软件产生的一个典型结果如图4所示，蛋白质为苹果酸脱氢酶1 NAD（可溶性的）的酸性异构式。使用Student's-test的p值为3.4 × 10^-7时，这个蛋白点的平均体积比率在E7070洗脱液中增加了7.72倍。

结 论

    利用Ettan DIGE系统的2-D DIGE技术已经成功用于剖析小药物分子的结合蛋白质。准确的蛋白点定量允许样品之间观察到的蛋白质丰度差异是真实的这一情况高的统计学可信度。在这个应用中，Ettan DIGE系统能够鉴定特异地结合到药物分子而不结合到没有活性的类似物的蛋白质。因此，本研究中鉴定的蛋白质现在能够被进一步研究，以便获得E7070体内活性机制的更多知识。

参考文献

1. Alban, A. et al. A novel experimental design for comparative two-dimensional gel analysis: Two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating a pooled internal standard. Proteomics 3, 36-44 (2003).
2. Yan, J. X. et al. Fluorescence two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry based proteomics analysis of Escherichia coli. Proteomics 2, 1682-1698 (2003).