传统双向电泳(2-DE)是广泛使用的蛋白分析技术， 但是在鉴别组织样本的蛋白丰度变化中的应用受到了系统偏差和低灵敏度的限制。这些局限性已经极大地限制了该技术在鉴别稀有样品，例如从激光捕获显微切割(LCM)系统得到的样品的蛋白差异。
    本研究证明了双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)的应用来检测从LCM获得的样品的蛋白丰度差异。该分析利用新型的荧光标记物，CyDye^TM DIGE荧光饱和标记染料，来标记蛋白和提供检测微量蛋白丰度变化所需的灵敏度。结合内标和利用Ettan^TM DIGE系统，从大鼠表达人淀粉样蛋白前体(APP)的海马中的蛋白与那些来源于正常动物的蛋白进行比较。这一工作补足了Kondo等的更全面的工作。

前 言
    在传统双向电泳中的凝胶之间的偏差使之很难区别系统偏差和诱导的生物学差异，意味着在蛋白表达中的差异很少能够被可信的预期。而且，该技术不适合用于分析低丰度蛋白。双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)与传统方法相比具有非常显著的优势。在2-D DIGE中利用Ettan DIGE系统，样品被用CyDye DIGE荧光标记物中的一种进行预标记，然后可以被混合并与内标一起在同一块胶上分析。

    为了证明CyDye DIGE荧光饱和标记染料在稀有，低丰度样品的蛋白质组学研究中的应用，我们选择了神经变性紊乱阿尔茨海默病(AD)的研究作为我们的模式系统。基于正常和带有人APP基因的转基因大鼠，系统利用LCM来富集富含CA1区域的大鼠海马中的一个区域用于进一步分析。在电泳之前，样品被用带荧光的，光谱分开CyDye DIGE荧光饱和标记物分别标记，随后与内标一起在同一块2-D胶中共电泳。
    CyDye DIGE荧光饱和标记物分子的分子量大约680，质量经过匹配以使标记的蛋白给出相等的迁移。该荧光标记物与蛋白样品中所有可利用的半胱氨酸残基反应，得到高标记浓度。因为它们的净 电荷为零，荧光标记物与半胱氨酸巯基结合得到的标记蛋白的电荷不变。CyDye DIGE荧光饱和标记物使痕量/有限的样品(一般每个标记反应5μg蛋白)可以被观察到，因为它们的高发射强度和用来扫描凝胶的Typhoon^TM 9400系列多功能成像系统的灵敏度。CyDye DIGE荧光饱和标记物比Coomassie^TM、银染或Sypro^TM染料等染色方法灵敏度更高，动态范围宽。
    结果清楚说明了这一2-D DIGE标记技术用于分析非常少量复杂样品是非常合适的，和利用MALDI-ToF质谱结合数据库检索的高通量蛋白识别的界面。Ettan设计的蛋白质组学平台也被进一步应用在其它模式系统的研究中。

方 法

样品制备
    选出9个雄性野生型大鼠(Fischer F344品系)和9个雄性同一品系的带有人APP751同等型包含“Swedish"在HMGCoA还原酶启动子的控制下的双突变转基因大鼠被选择，称重250-300g(大约3个月大)。取出整个大脑在液氮中冷冻。为了准备分析2-D凝胶的样品，脑组织被放置在含有2% w/v 羧甲基纤维素的铝制卡盘中，用一个Brights低温保持器在-12°C切成30μm厚的组织切片并解冻放在膜玻片(Leica，英国)上。切片用空气吹干30分钟冷冻储存在-70°C直到使用之前。在海马CA1区周围组织的大面积(大约280000μm²)被选中并通过显微切割用Leica AS LMD(Leica，英国)切下来。组织切片在LCM之前没有进行复染。从切片切下来的部分被收集在放在载玻片下的一个微量离心管盖上(Eppendorf,，德国)。盖子中含有40 μl样品裂解缓冲液包含30mM Tris，pH8.0，5mM醋酸镁，7M尿素，2M 硫尿，4%(w/v) CHAPS来裂解样品。在裂解液中的每个样品被转移到管中随后放置在超声水浴中的冰上，在冰上超声3x30s间隔。超声后在收集最终的上清前用台式微量离心机9000 x g离心30s。为了准备制备2-D胶的样品，海马被用手切碎，在进行如上文所述超声之前在冰预冷的裂解缓冲液中均浆。每个裂解物的蛋白浓度用一种与去污剂相兼容的蛋白测定(Protein Determination Reagent, USB)来确定。

样品标记
    为了得到在野生型和转基因大鼠之间的差异的统计上准确的数据，等量的(5 μg)每一种野生型和转基因蛋白样品被混合作为混合的内标。标准样品被用CyDye DIGE Cy^TM3饱和标记染料大批标记足够量在每一块胶上都包含一个内标。从每个野生型或转基因大鼠得到的蛋白(5 μg)被分别用CyDye DIGE Cy5饱和标记染料标记。
    每个大鼠海马CA1-富集的蛋白裂解物的5 μg小份