 |
| Stratagene 产品促销 | Novagen 产品促销 | 现货产品 | 蛋白酶及其抑制剂 |
| Stratagene最新Newsletter15:3介绍 | Novagen最新Newsletter介绍 |
|
|
|
试剂盒常见问题解答 自1995年上市以来， QuikChange®系列突变试剂盒受到了广泛的认可和称许，并已成为蛋白结构-功能研究的首选。你可以从2100多篇学术论文参考 QuikChange®的应用，更可以从2002年的400多份公开发表的研究报告中了解到 QuikChange®为蛋白功能研究进展作出的卓越贡献…… Stratagene系列QuikChange® 定点突变试剂盒功能多样，适合所有体外突变研究应用。常规QuikChange®定点突变试剂盒是快速、简单、可靠地制备<8kb质粒上单点突变(包括氨基酸置换、插入或删除)的最好选择。QuikChange®XL定点突变试剂盒则优化用于结构复杂的片段或>8 kb的片段。QuikChange®多点突变试剂盒基于独创的设计，可以完成在一个模板上5个不同位点引入突变，适合用于制备半随机点特异性文库。 常见问题解答： 有3种QuikChange®突变试剂盒：常规QuikChange® kit，QuikChange® XL kit和 QuikChange® Multi kit。(top) QuikChange®和QuikChange® XL用于制备位点特异性突变，氨基酸置换、删除，插入单个或多个氨基酸，但是不会造成任何意外突变。QuikChange®最适合用于小于8 kb的模板，而QuikChange® XL经优化更适合用于大于8 kb模板的突变。QuikChange® Multi采用独特的机制，能在小于8kb的模板上引入5个不同位点的突变或氨基酸置换，而且不会造成任何意外突变。(top)QuikChange®可以从任何双链质粒模板起始，快速方便、可靠高效地制备突变产物。因此用户完全不必进行ssDNA拯救或用其它载体亚克隆。另外，QuikChange®对载体无特殊要求，不需要特别的限制性位点及多步转化操作。该试剂盒包括反应所需的所有试剂，用户不必另行购买其它配套产品。(top) QuikChange® (包括常用型和XL型)：与载体双链分别互补的一对突变引物经温度循环将突变带入新生成的扩增产物中。由于引物经特别设计，每轮扩增开始时，都会有新的引物与原始模板杂交。整个扩增完成后，用Dpn I处理去除带甲基化的原始模板链。将带缺刻的突变产物转入XL2-Blue超级感受态细胞，细菌连接酶修复缺刻后，突变质粒即可在细菌中正常复制了。铺板后，80%以上的克隆会带有突变。 QuikChange®多点突变试剂盒可以快速、可靠地在质粒DNA上同时完成5个定点突变。每个突变位点设计一个相应的寡核苷酸引物，直接采用双链DNA模板，只需经1天3步的操作即可完成。 根据双链模板之一合成包括突变的引物，PfuTurbo DNA聚合酶在非链置换反应条件下高保真进行扩增，得到双链DNA分子，其中之一带有多突变位点和缺刻。缺刻随即会被试剂盒所带的特殊混和酶封闭。扩增反应产物经Dpn I核酸内切酶消化，去除模板DNA，再转化XL10-Gold超级感受态细胞。(top) 所有QuikChange试剂盒均带有高保真PfuTurbo DNA聚合酶以最大限度减少碱基错配。另外，起始模板量很小，线性扩增以及扩增循环次数少等都是最低随机突变发生率的保证。(top) 要求用带甲基化的DNA。大多数种类的大肠杆菌都能对质粒DNA甲基化。只要DNA不是从dcm-或dam-(甲基化缺陷型)菌株中制备的，即可用作该试剂盒的模板。此外，模板DNA应是通过小提或氯化铯纯化制备的。(top) 几乎所有的分子生物学日常操作时采用的E. coli均可以用于与QuikChange®配套。下列菌株带有DpnI酶切必需的 dam 甲基化，可以明显降低背景。(top)
经实验证明，不用SDS-PAGE纯化引物，效率会降低约20%。(top) 经设计，该试剂盒采用的引物只扩增模板链，产物链不会被扩增。引物不会互相复制。由于序列方向不合，引物之一与另一引物的延伸产物不会退火，因此，产物链不会再被扩增。(top) DpnI专切甲基化和半甲基化DNA (5'-Gm6ATC-3'序列), 因此可用来去除模板DNA，仅剩下扩增产物。该试剂盒要求用作起始材料的质粒DNA必须是从dam+ E.coli制备的。从dam-菌株(例如JM110，SCS110) 分离的质粒DNA缺乏甲基化，因此不能使用。(top) QuikChange®是根据多数种类的E. coli带有dam甲基化活性，纯化自这些菌株的原模板带有甲基化的现象来去除原模板。Dpn I是专切甲基化和半甲基化DNA的限制性酶，因此可用于在线性扩增反应后消化原质粒DNA，这种设计保证了突变效率高而背景极低。(top) 4.5-kb的pWhitescript 对照质粒和引物可用于检测试剂盒的质量和效率。对照质粒带有1个终止密码子(TAA)，替代 β-半乳糖苷酶基因中的谷氨酸(CAA)。 XL1-Blue或 XL10-Gold 细胞经转化后，由于无β-半乳糖苷酶活性，在含有IPTG和X-gal的LB-氨苄培养基上生成白斑。对照引物则将终止密码子中的T突变为C，使终止密码子变成谷氨酸密码子，从而使β-半乳糖苷酶活性得以恢复，平板上出现蓝斑。(top)QuikChange®和QuikChange® XL试剂盒用于制备单点突变，效率大于80%。QuikChange® Multi试剂盒制备单点或双突变效率大于90%，制备三或四点突变效率大于50%，制备五点突变效率则大于30%。(top) 从2.9 kb和5.7 kb的重组子上删除12 bp效率均达100%。 有用户报告从5.6 kb质粒上删除84 bp片段获得58%的效率。(top) 从2.9 kb的重组子上插入12 bp效率均达95%。 有用户报告在8 kb 质粒上插入18bp片段获得80%的效率。(top) 某研究者报告在15kb重组子上改变1个氨基酸效率达到60%。 ·经 Stratagene公司检测，QuikChange® XL试剂盒可用11 kb的质粒。 ·某用户成功地进行了19 kb质粒上的点突变。(top) XL10-Gold超级感受态细胞具有Hte基因型，因此提高了连接DNA的转化效率。该细胞具有极高的转化效率(5x10^9转化子/ug DNA)，尤适用于大质粒转化。这种细胞也比XL 1-Blue长得快，因此可以获得更大的克隆。(top) QuikSolution是Stratagene的专有产品，对大质粒的线性扩增效果非常好。(top) QuikChange® Multi是目前唯一已经商品化的能在一个质粒上同时引入5个不同位点突变的试剂盒。与其它QuikChange®试剂盒机制不同，该试剂盒可以让你一次实验就完成5个点突变，还可以用简并核苷酸制备点特异性文库。突变反应或制备文库均可在1天内高效完成，并获得满意结果。该试剂盒要求每个突变位点的对应引物仅带有单个突变寡核苷酸(可使用简并寡核苷酸)。(top) QuikChange® Multi试剂盒的设计非常巧妙，引物、扩增酶和突变模板的制备都很有特点。QuikChange® Multi 针对每一个突变位点采用一个对应的磷酸化引物，而所有的引物都针对某一条链设计。试剂盒中的酶混和物是针对进行高效单链多点突变而设计的一种包括 PfuTurbo DNA聚合酶的特殊配方。(top) 可以。该试剂盒要求每个突变位点只有1个寡核苷酸改变，因此可以设计采用简并核苷酸随机替代氨基酸旁链上的某位点。因此，使用者可以用这个试剂盒制备一个质粒上带有各种1-5个氨基酸旁链的突变的文库。该文库即可用于进行蛋白结构-功能研究和蛋白进化研究的筛查分析。(top) QuikChange Multi 试剂盒中的4-kb对照模板及引物混和物设计用于同时制备3个独立位点的突变，因此可以用来检测试剂盒的质量和效率。 对照模板在LacZ编码区内带有3个终止密码子，可阻止 β-半乳糖苷酶活性，因此在含有IPTG和 X-gal的LB-氨苄培养基上不生成蓝斑。对照引物混和物包括3种引物，分别能将LacZ编码区内的一个终止密码子突变为正常密码子。只有当3个终止密码子完全恢复为正常密码子时，平板上才会出现蓝斑。(top)已经在8 kb质粒上成功完成了多点突变。(top) 根据同时做的突变数量不同，平均效率如下：
(top) |
Stratagene系列QuikChange®定点突变