是Sepharose 类介质的基质)，它的排阻极限与Sepharose 4B 相似(对球形蛋白质为20 MDa)。柱子用含0.1% Berol 185 的破碎液来平衡。因为它的排阻极限很大，可以让其它蛋白，核酸及其它细胞器等渗入凝胶内部，而只将包涵体蛋白质排阻在外。这样只收集在空体积V0 流出的峰，然后在用8 M urea 和0.2M DTE 完全溶解，还原后在室温下放置5-6 小时。然后再按照前面离心分离的方法，进行酸化后备用。最终溶解的蛋白质浓度为5.7 mg/ml，以此作为后继复性的起始样品液。

用稀释法复性包涵体蛋白质
     在稀释复性中，对pH, GSH与GSSG的比例与浓度，精氨酸浓度，样品量及复性温度等条件进行了优化。优化后的复性缓冲液组成即做为其它复性方法的基础。最优化的复性液组成为：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 含0.5 M 精氨酸，1mM EDTA, 1 mM GSH 及1 mM GSSG，这也就是后面常提到的复性缓冲液。25 ml 溶解了的包涵体(5.7 mg/ml 溶在8M urea) 样品稀释200 倍到此复性缓冲液中。

金属鳌合层析复性
     用5 ml 的Hitrap chelating 柱子，先用Ni 离子饱和，再用含8 M urea 的复性液平衡。然后将100 ml 溶解了包涵体(5.7mg/ml 溶在8 M urea) 的样品加入柱中。用平衡液将基线洗平，然后用200 ml 的线性梯度逐步由含8 M urea 的缓冲液过渡到复性缓冲液中。然后用含0.2 M 的imidazole 将复性后的scFv 洗出柱子。并考察了流速对复性率的影响。

透析复性
     100 ml 溶解了的包涵体(5.7 mg/ml 溶在8 M urea) 4℃下在300 ml 复性缓冲液中透析过夜。

用脲素及pH 梯度凝胶过滤复性
     先将HiLoad 16/60 Superdex 30用一个由上至下线性减少的urea 梯度(8 M 到0.4 M)，同时还存在一个从2-7.5 的pH 梯度平衡上部的60%的柱体积。我们通过先在柱中加入0.4柱体积的pH 7.5 含0.4 M urea的复性缓冲液，随后用0.6 柱体积的线性梯度从pH 7.5 含0.4 M urea 的复性缓冲液变成8M urea pH 2 的溶液中来实现这一点。这样当样品(溶于8M urea, pH 2.0 含5.7 mg/ml 的scFv 融合蛋白质) 加入柱顶后也同样处于与溶解液同样的环境中。因为蛋白质分子很大，并被所选凝胶介质完全排阻在外，因此它向下的速度要比urea等小分子快得多。这样可以通过预先形成的梯度，最后转移到柱子底部的含0.4 M urea 的复性缓冲液中，从而达到逐步脱除变性剂的目的。这个转移的速度由流速来控制，因此我们对流速在一定范围内(0.02到1.0 ml/min) 对复性率的影响进行了研究。同时也考察了样品的量(100 µl-1.0 ml) 对复性率的影响。每管收集1.0 ml。

     在对照实验中，用无梯度或仅有urea 梯度凝胶过滤复性做为对照。其它条件与脲素及pH 梯度凝胶过滤复性一样。

复性率的测量
     复性scFv的结合抗原活性是在BIAcore 2000 (Bioacore AB,Uppsala, Sweden) 上用BIA 的测量软件来进行测量。将具有抗原活性的小肽C19V NH2-CRGTGSNRSSFESSSGL VCONH2)通过-SH基团偶联到CM5 蕊片上。标准曲线由纯化的Fab57P 得到。

结果与讨论
包涵体蛋白质的分离

图2. A:E.coli细胞内含有表达的scFv57P融合蛋白质；B:Frenchpress破碎后的匀浆，均用相差显微镜观察得到。

图3. 一步凝胶过滤分离纯化scFv57P包涵体蛋白质色谱图，*代表包涵体蛋白质的峰。

     一种新的分离方法取代了原来的离心与洗涤过程。通过溶菌酶，DNase，EDTA，非离子形表活剂Trition X-100或Berol185 在French press (APV-Gaulin) 下循环3 到4 次后，可以使细胞的碎片及核酸等其它杂质的尺寸比包涵体蛋白质都 要小(Fig.2)。通过选择合适的大孔凝胶过滤介质，如4%的agarose [Sepharose 4 FF or Sepharose HP 的基质]。它可以使细胞碎片，多糖，核糖体等杂质从介质中透过，而完全排阻包涵体颗粒。从而，经过层析柱后，可以达到分离纯化包涵体的目的。