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IncuCyte实时动态成像技术在“细胞自噬”方面的应用

IncuCyte实时动态成像技术在“细胞自噬”方面的应用

上海典奥生物科技有限公司

引言:

 

2016年度诺贝尔生理学与医学奖获奖者为日本科学家大隅良典(Yoshinori Ohsumi),以奖励他在“细胞自噬机制方面的发现”。什么是“细胞自噬”?细胞自噬是细胞组分降解与再利用的基本过程。自噬” (autophagy)一词源于希腊语前缀“auto-” 以及另一个希腊语单词“phagein”,前者意为自我,后者意为吞食。因此,自噬作用的意思非常明确,那就是自我吞噬(参考文献1)。

 

“自噬”概念最早出现于上世纪1960年代,当时研究人员发现细胞能够消灭自身内部物质,方式是将其包裹进一个膜结构中,从而形成小型囊体并被输运至被称作溶酶体的回收机构进行分解。“自噬”的研究非常困难,直至上世纪1990年代,在经过一系列出色的实验之后,日本科学家大隅良典利用面包酵母找到了与自噬作用有关的关键基因。随后他开始致力于阐明酵母菌体内自噬作用的背后机制,并发现与之相似的复杂过程也同样存在于我们人类的细胞内。大隅良典的研究更新了我们关于细胞物质循环的旧有观点,他的研究开启了理解自噬作用在许多生理过程中关键作用的崭新道路,如生物体对于饥饿的适应或者机体对于感染的反应。自噬基因的突变会导致疾病的发生,自噬作用机制在一些类型的疾病,如癌症和神经疾病等病症中也发挥了作用(参考文献1)。

 

在最新的有关“细胞自噬”的研究文献中,我们挑选了五篇文献,均运用“IncuCyte实时动态细胞成像技术”从不同侧面研究了自噬现象。

 

美国Essen BioScience公司的IncuCyte长时间动态活细胞成像及数据分析系统能在预先设定的时间点,在培养箱中对多达6384微孔板进行实时动态活细胞成像。IncuCyte ZOOM可同时得到高清晰度相差图像、绿色荧光图像和红色荧光图像。强大的分析软件可以对图像进行定量分析,并得到曲线和图表。适用于细胞增殖监控、报告基因、细胞凋亡、细胞毒性、细胞迁移/侵袭、血管新生、神经细胞跟踪、趋化运动、噬菌作用、免疫细胞杀伤等应用。具体介绍,请参考:

 

IncuCyte介绍网址链接:http://www.ebiotrade.com/instrument/instrument_productDetail.aspx?productID=34b740d2-750c-41f8-b837-eeb2e2228d6e

 

文献简述如下:

 

(一) (一)通过调节IL6的分泌,自噬行为支持乳腺癌干细胞的维持(Autophagy Supports Breast Cancer Stem Cell Maintenance by Regulating IL6 Secretion)(参考文献2,影响因子4.510

 

文献摘要:

 

“细胞自噬”是细胞通过降解细胞内物质以提供营养物和能量使之在压力环境下存活的机能。自噬被认为是癌症干细胞(cancer stem cellCSC)或肿瘤触发细胞(tumor initiating cell)维持的关键过程。但自噬是如何支持CSC存活的机理始终不为人知。在本研究中,通过敲除ATG7BECN1基因来抑制自噬,自噬的抑制可通过调节CD24IL6的分泌改变乳腺癌细胞里的CD44+/CD24low/-组群。在不依赖自噬生存的乳腺癌细胞系中,自噬抑制增加了分泌到培养基里的IL6的量;而在依赖自噬的细胞系中,自噬抑制降低了IL6的分泌、细胞存活和微球体(mammosphere)的形成。在这些细胞中,对具有自噬能力的细胞进行IL6治疗或提供条件培养基可以挽救由于自噬抑制引起的微球体的不足。这些结果揭示自噬可通过调节IL6分泌来调控自噬依赖型乳腺癌细胞的CSC维持,从而揭示自噬是乳腺癌的潜在的治疗靶点。

 

实验方法:

 

为检测细胞的增殖和死亡,细胞被种在96孔板中,用IncuCyte系统(Essen BioSciences)成像。首次扫描后,加入细胞凋亡Caspase 3/7绿色检测试剂或YOYO3试剂。培养72h后再加入YOYO3试剂。细胞生长曲线由汇合度计算得到,细胞死亡曲线表达了绿色/红色荧光汇合度百分比,这些数据均使用IncuCyte10倍物镜每4h成像一次得到。在微球体(mammosphere)实验中,将细胞种在24孔板中。用IncuCyte的全孔成像模式拍摄72h。结果显示红色荧光汇合度百分比。

 

实验结果:

 

1.依赖于自噬和不依赖于自噬的乳腺癌细胞系的细胞增殖和凋亡。

 

1中,不依赖于自噬的MCF7细胞和依赖于自噬的MDA-MB-468细胞用包含自噬作用关键基因ATG7BECN1shRNAs的慢病毒转染以敲除自噬基因。NS表示非沉默对照(Non-silencing control),ATG7BECN1沉默表示自噬被抑制。用IncuCyte成像系统检测60小时的细胞增殖(实时图像的汇合度百分比),caspase活化(发出绿色荧光的Caspase 3/7底物的汇合度百分比)和总细胞死亡(同一个图像中的YOYO3红色荧光的汇合度百分比)。在图A中,显示每三个重复中的代表性曲线。显示自噬抑制时,在MDA-MB-468细胞中,与MCF7细胞相比,细胞增殖明显降低,细胞凋亡明显增加。在图B中,绿色汇合度(caspase 3-7活性,表示细胞凋亡)曲线的曲线下面积(AUC),或红色汇合度(用YOYO3表示的总细胞死亡)曲线的曲线下面积(AUC)用增殖曲线的AUC(表示细胞总数)进行归一化处理。比较自噬缺失的MDA-MB-468细胞(表达ATG7BECN1 shRNAs)和MCF7细胞,显示在自噬抑制时与MCF7细胞相比,MDA-MB-468细胞发生明显的细胞凋亡(左图)和细胞死亡(右图)。以上图A和图B中,不依赖于自噬的MCF7细胞均不受自噬抑制影响。

 

2.自噬调节的IL6的分泌有助于MDA-MB-468乳腺癌细胞系的微球体形成。

 

2中,细胞核表达cherry荧光的MDA-MB-468细胞,用非沉默(non-silencingNSshRNAATG7 shRNA转染,用IncuCyte拍照评估微球体的形成效率。图A表示拍摄7天,图B表示拍摄48h。在图A中,与对照相比,自噬抑制引起微球体形成的减少。在图B中,细胞在种植时用IL6处理,或使用从已成功生成微球体3天的非转染细胞处得到的条件培养基(conditioned mediaCM)培养。这两种处理方法都能有助于MDA-MB-468乳腺癌细胞系的微球体形成。

 

(二) (二)自噬抑制可促进BRAFV600E脑瘤的化疗敏感性(Autophagy Inhibition Improves Chemosensitivity in BRAFV600E Brain Tumors)(参考文献3,影响因子19.453

 

文献摘要:

 

自噬抑制是癌症的潜在的治疗策略,但是人们并不知道可治疗哪些肿瘤。BRAFV600E的突变被证实在小儿科中枢神经系统(central nervous systemCNS)肿瘤中非常重要,也能影响其他类型肿瘤的自噬行为。我们评估了有BRAFV600E突变的CNS肿瘤细胞,发现突变细胞(非野生型)显示了高概率的诱导的细胞自噬,并对药物或基因引起的自噬抑制敏感,在临床使用的自噬抑制剂氯喹(chloroquine)和Raf抑制剂vemurafenib联合使用,或氯喹与标准化疗联合使用时显示协同作用。重要的是,我们也证明,氯喹可增进抵抗性体外原代细胞培养中的vemurafenib的敏感性,并第一次证明,向用vemurafenib进行V600E突变的病人体内,加入氯喹可以增加临床疗效。这些发现表明,发生BRAFV600E突变的CNS肿瘤是自噬依赖性的,可以将自噬抑制作为靶点,结合其他治疗策略联合治疗。

 

实验方法:

 

IncuCyte进行肿瘤细胞的生长监控。细胞以每孔2000个的密度种植在96孔板上,用IncuCyte ZOOM进行培养监控。每孔用10倍物镜取4个独立的视野进行成像,成像间隔为4小时。每个实验做三重复,用汇合度显示细胞的生长曲线。

 

实验结果:

 

3.三种细胞的细胞生长曲线

 

3中,图(C)表达对照组、ATG5 shRNAsATG12 shRNAs的细胞在标准培养基中生长72小时。用IncuCyte实时动态成像系统得到细胞的生长曲线。数据显示平均值±SEM。结果显示:用shRNA转染敲除ATG5ATG12基因的BRAFV600E突变的细胞与对照组相比,其细胞增殖降低了,这是因为基因敲除抑制了细胞自噬作用。

 

(三) (三)自噬因子DRAM1p62可调节胶质母细胞瘤干细胞中的细胞迁移和侵袭(The autophagy-associated factors DRAM1 and p62 regulate cell migration and invasion in glioblastoma stem cells)(参考文献4,影响因子8.459

 

文献摘要:

 

多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)的侵略性表现在它在原位的侵袭和对治疗的抵抗。在已形成的GBM中,有一类是具有干细胞特性的肿瘤形成细胞(GBM stem cells, GSCs),被认为导致对治疗的抵抗。自噬的代谢通路显示在GBM的存活的调节中。然而,GBM的自噬状态和它在癌症干细胞中的作用还未查明。我们发现,携带间叶细胞标记(mesenchymal signature)的GBM肿瘤中,一些自噬的调节子得到高度表达,可以影响其侵略性和侵袭性,这也与MAPK通路的成分有关。这个自噬的标记包括自噬相关基因DRAM1SQSTM1,编码一个关键的选择性自噬的调节子p62。高表达的DRAM1GBM病人的更短的存活期相关。在GSCs中,DRAM1SQSTM1的表达与MAPK的活化和间叶细胞标记物c-MET的表达相关。DRAM1的敲除降低了p62在自噬体上的定位和它的自噬介导的降解,暗示了DRAM1p62介导的自噬中的作用。相反的,由饥饿或mTOR/PI-3K抑制诱导的自噬不受DRAM1p62下调的影响。功能性地,DRAM1p62调节GSCs中细胞的运动和侵袭。这和能量代谢的改变有关,特别是降低的ATP和乳酸水平。综合而言,这些发现阐明了自噬在GBM中的作用,并揭示了自噬调节子DRAM1p62在控制癌症干细胞的迁移/侵袭中的新的功能。

 

实验方法:

 

因为在活跃的侵袭性/迁移性胶质母细胞瘤干细胞(glioblastoma stem cellsGSCs)中诱导出自噬,我们决定确定是否敲除自噬因子DRAM1p62会影响细胞迁移和/或侵袭。用IncuCyte实时动态成像仪的细胞迁移模块(Migration Module)进行成像及分析,记录划痕愈合随时间的曲线,横轴表示时间,纵轴表示细胞运动的距离。

 

实验结果:

 

4. 自噬抑制对细胞迁移能力的影响

 

4表示下调自噬调节因子会损害划痕实验表达的细胞迁移和细胞侵袭小室实验表达的细胞侵袭。(a)使用ScrambleshDRAM1.1shDRAM1.2 G166细胞的划痕实验的代表性图像。图像通过IncuCyte实时动态成像仪每隔2小时获取并分析。中间图像的划痕愈合曲线显示细胞迁移进行了长达78小时。右侧图像显示72小时完成的迁移距离。DRAM1的两种shRNA序列,与Scramble细胞相比,都能明显减少划痕的愈合。(bc)敲除ATG7ATG5可以抑制迁移,在(b)中,叠加的曲线显示敲除ATG7和敲除DRAM1对细胞迁移有相似的影响。而敲除p62d)没有显示对划痕迁移实验的影响,可能是由于缺少p62的细胞的生长能力得到了提升,细胞生长是划痕实验的干扰因素,因此我们又考察了去除生长因子(GF)的G166细胞的划痕愈合实验。(e)在缺少GFGSCs中,下调p62会得到类似于敲除DRAM1ATG7的相似的划痕愈合的降低结果。敲除自噬调节因子会损害缺少生长因子的G166细胞的运动能力。

 

(四)(四)mTORC1的抑制可通过活化MnK/eIF4E通路促进Chikungunya蛋白的翻译(Inhibition of mTORC1 Enhances the Translation of Chikungunya Proteins via the Activation of the MnK/eIF4E Pathway)(参考文献5,影响因子7.562

 

文献摘要:

 

Chikungunya病毒(CHIKV),一种横跨五大洲的主要传染病的病原体,是一种正链mRNA病毒,利用细胞的cap-dependent翻译机制进行复制。虽然病毒的感染抑制了mTOR,一种控制cap-dependent翻译的代谢传感器,病毒蛋白还是被高效的翻译。用Rapalog进行处理,或将mtorraptor基因沉默,而不沉默rictor基因,可进一步促进培养细胞中的CHIKV感染。使用生化实验和实时成像技术,我们证明这种影响与自噬无关或与1型的干扰素生产无关。为提供与我们发现相关的体内实验证据,我们用mTORC1抑制剂处理小鼠,显示了致死性增加并显示对CHIKV的更高的灵敏性。对病毒生命周期的系统评估显示,抑制mTORC1对病毒蛋白有特别的正面影响,可通过增加结构性和非结构性蛋白的翻译促进病毒复制。分子分析定义了磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和MAP激酶活化的蛋白激酶(MnKs)活化的角色功能,导致了eIF4E的过度磷酸化。最后,我们显示在CHIKV抑制mTORC1的环境下,通过相似的机能,病毒复制优先于宿主翻译。我们的研究揭示了一个出乎意料的旁路通道,通过该通路,CHIKV蛋白翻译克服了病毒诱导的mTORC1抑制。

 

实验方法:

 

IncuCyte的实时成像方法测量实验中的细胞被CHIKV感染的效率。在24孔板和96孔板中,将鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cells, MEFs)用CHIKV-GFP 5’感染,用IncuCyte实时成像系统对报告基因成像。用20倍的物镜对每个孔中4个独立的950x760μm2的区域进行以1小时为间隔的成像。培养物保持在37℃,在ThermoHera cell 240培养箱中培养,所有实验三重复。用IncuCyte软件对GFP+细胞进行计数,结果以每mm2的绿色荧光对象个数表示。将每个孔中的四个视野中的数值进行汇总,并结合三重复算出平均值。IncuCyte的实验结果还可以制作成录像。

 

实验结果:

 

5.MEFsCHIKV-GFP感染,用IncuCyte观察细胞中GFP阳性细胞(报告基因)的个数。

 

5B)是CHIKV-GFP结构的示意图。缺乏自噬作用关键基因的MEFsCHIKV-GFPMOI=1)感染,加入Rapamycin100nM)或TORISEL0.1mg/ml),RapamycinTORISEL均为mTORC1的抑制剂。用实时动态成像仪IncuCyteGFP阳性细胞进行计数,GFP阳性细胞代表CHIKV感染细胞。图像显示GFP染色(绿色对象个数)和曲线显示了感染的动态过程,相似的结果也在其他7个独立的实验中显示。实验结果表明mTOR的抑制促进了培养细胞的CHIKV感染,说明mTORC1的抑制可促进病毒蛋白的翻译,而与自噬无关。

 

(五) (五)在无血清培养的神经胶质瘤细胞中,ABT-888促进替莫唑胺的独立于MGMT状态的细胞毒性影响(ABT-888 enhances cytotoxic effects of temozolomide independent of MGMT status in serum free cultured glioma cells)(参考文献6,影响因子3.694

 

文献摘要:

 

背景:目前的多形性成胶质细胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)的治疗标准包括分次聚焦的放疗和同时进行替莫唑胺(temozolomide, TMZ)化疗。一种增加TMZ疗效的有前途的治疗策略是用聚ADP核糖聚合酶蛋白抑制剂(PARPi)对DNA损伤修复机能进行干涉。目前研究的目标是探索对来源于病人的神经胶质瘤干状细胞(glioma stem-like cells, GSC)的联合治疗的成果。

 

方法:在已建立的GBM细胞系U373T98上检测联合治疗的可行性。我们开发了一个体外药物筛选方法,基于来源于原发型患者组织样本(n=20)的GSC培养,来评估PARPiABT-888)单独治疗的作用和与TMZ联合治疗的作用。治疗效果用存活率,双链断裂,凋亡和自噬实验检测,并进行了纵向的显微细胞监控(IncuCyte)实验。O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的状态用甲基化实验和western blots的蛋白表达实验确定。

 

实验结果:10μMPARPi的单独治疗可降低超过25%的细胞存活率,概率是20GSCs中有4个(20%)。50μM100μMTMZ的单独治疗分别对20GSCs中的12个和14个有效。在100μM剂量中,TMZ抵抗在8MGMT蛋白阳性培养中的7个中被发现。TMZ治疗和PARPi的协同作用在90%GSCsn=20)中发现,其中6个是初期抵抗,7个是对TMZ单独治疗敏感。在响应的GSCs中也观察到增加的双链断裂诱导和凋亡。虽然统计学上不明显,但我们注意到一个趋势,即在western blots和自噬体积聚中都能观察到自噬的增加。


结论:当同时进行时,PARPi介导的TMZ的协同作用与TMZ敏感性无关,并且可以推翻MGMT-)介导的抵抗。对联合治疗的反应伴随着增加的双链断裂的诱导,与增加的细胞凋亡和自噬一致。加入PARPi可在原代GSCs中和TMZ治疗一起协同作用。PARPi可以潜在地增加GBM标准治疗的效果。

 

实验方法:

 

细胞增殖实验:用IncuCyte实时动态活细胞成像仪观察细胞的汇合度,细胞种在96孔板中,放置在IncuCyte中培养,每1-3小时拍摄一张相差图像,用IncuCyte软件计算每个孔的汇合度。

 

双链断裂实验:用IncuCyte观察yH2Ax阳性细胞个数。

 

细胞凋亡:为检测单独治疗和联合治疗诱发的细胞凋亡,在加入药物的的同时加入Essen BioScience公司的Cell Player Caspase3/7细胞凋亡试剂,稀释比例1:1000,用IncuCyte FLR记录加入试剂48小时后的凋亡细胞和总细胞的比例。

 

细胞自噬:为检测单独治疗和联合治疗诱发的细胞自噬,我们使用Enzo Life Sciences公司的Cyto-ID自噬检测试剂盒,它可以提供单丹磺酰戊二胺染料,特异性地对自噬体进行染色。细胞用药物处理后用IncuCyte FLR观察,检测自噬体。在软件处理过程中,先设定检测自噬体的荧光强度阈值,再计算每孔的自噬体的个数。

 

实验结果:


 

6.PARP抑制会增加TMZ诱导的GSCs细胞的双链断裂,自噬和凋亡

 

6表示(A)联合治疗促进了DSB诱导。计算GSCsMGMT+)和MGMT-)中的yH2Ax阳性细胞个数,作为药物处理16小时后DSB诱导的指示剂。GS160细胞的结果与非处理对照组对比十分明显。(B)联合治疗明显促进了应答GSCs的凋亡诱导,而没有促进非应答GSCs。用实时成像计算药物处理48小时后凋亡阳性的细胞个数。在联合治疗后,与单独治疗相比,GSC79细胞的凋亡细胞明显增加。GS160细胞没有受到TMZ/ABT-888药物联合治疗的影响,而正对照能够成功地诱导凋亡。(CTMZABT-888可以诱导GS79细胞的自噬,联合治疗增加了这个效应。计算每个孔中的自噬体个数,并和无处理对照对比。药物处理16小时后读数。与对照相比,所有治疗的自噬体个数都增加。然而联合治疗与用ABT-888TMZ单独治疗相比,增加不是很明显。(DIncuCyte FLR得到的代表性图像反应了GS79染色的自噬体。请注意细胞内部的荧光斑点的聚集,特别是哪些增大的病变的细胞。(E)在GS79中,与单独治疗相比,联合治疗促进了autophagic flux。加入药物后24小时做Western blot,显示LC3-11的积聚,表明autophagic flux的增加。Actin是上样对照组。

 

总结:

 

以上5篇自噬研究的代表性文献都运用了美国Essen BioScience公司的IncuCyte长时间动态活细胞成像及数据分析系统进行实验研究。进一步了解IncuCyte仪器及实时动态活细胞成像技术,请联系Essen的中国总代理“上海典奥生物科技有限公司”,021-58605185-822(刘小姐),marketing@tekon.com.cn,或关注微信公众号:“典奥生物科技”或“tekontech”。

 

 

参考文献:

(1)  (1)获得诺贝尔奖的“细胞自噬”是什么:人类细胞一个重要机制,新浪科技微博,2016103

(2)  (2)Maycotte, P. et.al., Autophagy Supports Breast Cancer Stem Cell Maintenance by Regulating IL6 Secretion, Mol Cancer Res., 2015 

(3)  (3)Mulcahy Levy J.M. et.al.,Autophagy Inhibition Improves Chemosensitivity in BRAFV600E Brain Tumors, Cancer Discov. 2014 July,4(7),pp.773-780

(4)  (4)Galavotti,S. et.al., The autophagy-associated factors DRAM1 and p62 regulate cell migration and invasion in glioblastoma stem cells, Oncogene,2013,32, pp.699-712

(5)  (5)Joubert, P.E.et.al. Inhibition of mTORC1 Enhances the Translation of Chikungunya Proteins via the Activation of the MnK/eIF4E Pathway, PLOS Pathogens, 2015, August 28

(6)Balvers, R. et.al., ABT-888 enhances cytotoxic effects of temozolomide independent of MGMT status in serum free cultured glioma cells, Journal of Translational Medicine, 2015, 13:74