3.微生物酶分子的人工进化

3.1.热稳定性的人工进化

    在一般工业过程中，高温可以提高底物的溶解度，降低反应基质的粘度，减少微生物污染以及提高伴随发生的非酶促反应的速率。因此，在微生物酶分子的改性和人工进化研究中，大量的研究目标是提高本科分子的热稳定性。一般而言，单一位点上的有益突变可以将酶分子的解链温度（Tm）提高1-2摄氏度。Pjura等通过随机突变，向T4噬菌体溶菌酶中引入了不起1个点突变使其热稳定性提高0.8-1.4摄氏度^[10]。Haruki等则在对大肠杆菌核酸酶H1的研究中发现，引入个点突变后，其Tm提高4.2摄氏度，同时发现，对某一氨基酸残基进行点突变后，Tm 提高了7.8^[11] 摄氏度。同样，Joyet等通过随机突变将α-淀粉酶的Tm提高了11摄氏度，在90摄氏度下的半衰期提高了近10倍^[12]。进一步对其氨基酸残基组成和顺序进行分析发现，改性的α淀粉酶中仅发生一个氨基酸残基的改变。在赋予卡那霉素抗性的卡那霉素核苷转移酶中引入2个点突变，则其Tm提高了15摄氏度。

3.2.适应人工环境的酶的分子热稳定性或活性的人工进化

    有机溶剂的使用可提高某些底物的溶解性或者增加底物间的相互反应速率。但在自然界存在的酶分子，通常在有机溶剂和水-有机混合溶液中失去原有的催化活性。提高随机突变和筛选从枯草芽孢杆菌蛋白酶E获得的一个突变株能够在60%二甲基酰胺水溶液中保持与在水溶液中相等的酶活；同样，通过随机突变和基因重组将p-硝基苯酯酶在30%二甲基甲酰胺水溶液中的酶活提高了100倍以上^[13，14]。某些酶在较低温度下保持较高的酶活同样为若干应用过程所必需。Kano等通过人工进化方法从嗜中温枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN’在10摄氏度时的酶活提高10%，在1摄氏度时的酶活提高30%，而更高温度下的酶活保持不变^[15]。

    在洗涤剂用酶的研究和应用中，改变和消除酶活性和稳定性对金属离子的依赖性也极为重要，因为，几乎所有洗涤剂中都含有金属螯合剂。用于洗涤剂中的蛋白酶一般皆需要金属离子来维持其活性和稳定性。Bryan等首先将枯草芽孢杆菌蛋白酶的钙离子结合区进行缺换突变，产生了高度不稳定的枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体，再随机引入10个氨基酸残基到这一钙离子结合获得新的突变体，在低浓度游离钙离子溶液中的酶活半衰期提高12.5 倍，进一步进行随机突变和筛选，获得更为稳定的非钙离子依赖性枯草孢杆菌蛋白酶突变体。钙离子依赖α-淀粉酶和糖化酶的活力和稳定性维持中也同样存在。运用人工进化方法已成功地将糖化酶的酶活和稳定性维持的钙离子依赖性消除并已成功地开发出商业用酶。

3.3.底物特异性和通过对新底物催化活性的人工进化

    在这类酶分子人工进化研究中，通过突变降低酶分子的Km值一般皆可有效地提高酶的催化效率。Sidhu和Borgford在研究中得到一个Streptomyces griseus蛋白酶B的突变体，其针对P1结合位点上带有蛋氨酸的多肽的活性明显提高而其催化常数不变^[16]。在对T7RNA多聚酶向DNA多聚酶活性的人工进化研究中发现了相似的结果。同样，在改变腺苷酸环化酶的一级底物活性的研究中得到鸟苷酸环化酶活性提高4.5倍的突变体，而原有的腺苷酸环化酶的活性仅存4%；在同一研究中还获得既保持原腺苷酸环化酶活力不变，又使鸟苷酸环化酶活力提高3倍的突变体，由此拓宽了酶的底物范围。Zhang等运用DNA体外随机拼接技术对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的底物特异性进行人工进化，经过7个循环，获得更高果糖底物特异性酶活。进一步研究发现，突变体酶分子中的6个氨基酸残基被置换，其中3个位于底物结合口的功能区3内，另外3个则既不位于底物结合口也不位于酶活中心^[17]。

3.4.对映体立体选择性的人工进化

    转氨酶已被成功用于从前 体酮基化合物生产手性胺类化合物。转氨酶也用于拆分含有不正确的立体化学性质的胺的消旋混合物。Matcham和Bowen对一个催化β-四酮转变成胺的转氨酶进行人工进化，从10000个克隆中筛选获得10个突变体，其对映体选择性从65%提高到90%以上^[18]。

4 结束语

    通过随机引入点突变到某一DNA分子中的传统方法有化学诱变法、物理诱变法、致突变宿主细胞法、有毒核苷酸掺入法等，这些方法在特定情况下仍然是一些有用的技术。对于那些酶分子的三级结构已经比较清楚，通过寡核苷酸盒PCR技术对特定区域的核苷酸序列进行定点空谈和一段序列的置换也是极有效的方法,如蛋白酶的抗氧性能就是通过这一方法获得改性的.然而,所有这些人工进化方法都离不开对某一酶分子编码基因DNA的获得.因此,通过分子生物学技术对那些尚不能进行人工分离培养或尚未被人类所认识的、但在自然界中确实存在的微生物酶基因的直接筛选和克隆同样是十分重要和诱人的^[19、20]。

参考文献

[10]Pjura P,Matsumura M,Baase W A et al. Protein Sci, 1993,2:2217~2225

[11]Haruki M.Biol Chem,1994,269:904-911

[12]Joyet P，Declerck N, Gaillardin C. Biotechnology, 1992,10:1579-1583

[13]Moore J C, Arnold F H. Natl Biotechnol,1996,14:458-467

[14]Moore J C, Jin H M, Kuchner O et al. J Mol Biol,1997,47:46-51

[15]Kano H,Taquchi S,Momose H.Appl Microbiol Biotechnol,1997,94:4505-4509

[16]Sidhu S S, Borgford T J. J Mol Biol,1996,257:233-245

[17]Zhang J H ,Kawes G,Stemmer W P C. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:4505-4509

[18]Matcham G W,Bowen A R S.Chem Today,1996,14:20-24

[19]Hawksworth D L.Mycol Res,1995,99:127-128

[20]Dalboge H,Lange L.Trends Biotechnol,1998,16:265-272