长篇综述：细胞凋亡受体及信号传导（一）

细胞凋亡受体及信号传导

“生物通”通讯作者    徐韧

关键词：细胞凋亡，CD95，TNF受体，TRAIL受体，信号传导

一、 概述

     很久以前，人们就认识到在多细胞、发生分化的动物的发育过程中，细胞程序化死亡PCD（programmed cell death）即细胞凋亡起到了很重要的作用^[1]。一个著名的例子就是线虫（Canorhabditis elegans）的发育。发育成熟的线虫由1089个细胞组成，其中131个发生了凋亡。这一系统成为了解调控细胞凋亡的分子和信号途径的有力工具，通过对线虫的突变体的研究，发现了某些基因在细胞凋亡中有重要功能，如ced-3，ced-4，ced-9。除了在发育过程中，细胞凋亡在免疫反应也有重要作用。如在胸腺中对T细胞的负选择作用（negative select），外周组织中过活化淋巴细胞的去除等^[2]。同时，细胞凋亡缺陷会引起很多疾病，如各种癌细胞对凋亡有一定抗性，很多自身免疫疾病也是因为凋亡信号缺陷引起的。另外，一些神经系统疾病如帕金森综合症、Alzheimer也有细胞凋亡异常的现象^[3]。

     在发育过程中的细胞凋亡是很难研究的，因为凋亡的细胞很快被临近的细胞内吞。通常对凋亡时细胞形态和化学的研究都通过培养细胞来进行。细胞凋亡的基本特征是细胞质膜疱状化，磷脂酰丝氨酸外露，细胞骨架瓦解，transglutaminase 被活化，染色质聚集，DNA降解成50kb大小的片段，继而降解成核小体片段；在后面的阶段，细胞质和细胞核形成凋亡小体，最后被临近的细胞或巨噬细胞吞噬^[3,4,5]。细胞凋亡是一种比较“清洁”的去除细胞的方法，细胞消失的干干净净。

     虽然细胞凋亡在一些情况下被称为细胞自杀，但是大多数研究发现凋亡过程是由于外界因素引起的。紫外线，γ射线，热震惊，氧化胁迫，化学治疗药物，失去与基底膜的连接，糖皮质激素，细胞因子内吞，细胞凋亡受体因子如TNF、CD95L均能引起细胞凋亡。在每个细胞中，都含有能引起细胞凋亡的蛋白前体，同时也含有保护细胞免于凋亡的蛋白，这二者之间构成一个平衡体系。在发生凋亡的细胞中，不管是不同细胞还是不同物种，生化和形态的变化都十分相似，这说明凋亡的分子机制应该是普遍存在并且在进化中是保守的^[6]。例如人类的抗凋亡蛋白bcl-2可以部分的替代线虫中的ced-9的功能。

     每天人体内免疫系统都会产生数以百万计的T和B细胞，同时也有相同数目的细胞被清除。在对这些凋亡细胞的研究中，发现了一些受体具有诱导细胞凋亡的功能。这些受体包括T细胞受体/CD3，B细胞受体，CD2，CD4和鼠抗原Thy-1。同时，绝大多数受体可以归为同一受体家族，它们与TNF受体在结构上有相似性。这一受体超家族的特征是，在膜外区都有2－5个富含半胱氨酸的区域，这些受体都具有诱导细胞凋亡的能力。它们中有的还具有引起细胞增殖分化等的功能。这些受体包括：，TNFR－1，TNFR－2，CD95，TRAILR，CD40，CD30，CD27，OX－40，NGF－R，HVEN/ATAR/TR2，GITR等^[7]。

　

     随着“职业”诱导凋亡受体CD95的发现，受体在凋亡中的重要作用变的更为明显。CD95以前还被称为APO－1和Fas。CD95与TNFR－1比较发现，在它们的胞内区都有一个DD(death domain)区，这一区域对凋亡信号传递至关重要。后来人们又发现了一些其它含有DD的受体，TRAILR（DR3，DR4），在功能上它与TNFR、CD95类似，也可以诱导凋亡。本篇综述主要对这三个受体的结构和功能作一个概括。

二、CD95/CD95L及信号通路

1，CD95/CD95L
     CD95（APO-1/Fas）受体是诱导细胞凋亡受体家族的一员。它由三个半胱氨酸丰富的膜外区和一个称为死亡结构域（Death domain）DD的胞内区组成，DD区对信号传导是至关重要的。CD95的配体有CD95L和CD95抗体，其中CD95L是TNF家族的一员，它有两种存在方式，一种存在于细胞表面，一种以可溶形式存在于胞外。通过对CD95/CD95L基因缺失小鼠和儿童的研究表明，CD95系统的主要功能存在于免疫系统和肝脏。CD95/CD95L系统参与下调免疫反应和肝细胞的内环境稳定。这一系统还可能参与了其他器官的一些病的发病机理，这些病的特征是凋亡失调^[8]。

     CD95胞内区有一个80氨基酸组成的DD（death domain），DD可以在几乎所有死亡受体中发现。这些受体的配体据信都形成三聚体，三聚体配体通过与受体结和使受体三聚化。CD95的寡聚化可以由加入CD95抗体和CD95L来实现，在体内CD95L是CD95的重要配体，它通过诱导淋巴细胞和粒细胞凋亡来调节免疫反应，同时，某些肿瘤细胞表达CD95L也能引起自身凋亡。在一些自身免疫疾病中CD95L也起到了重要作用。最近还报道了一种不依赖配体的受体寡聚化，紫外线照射可以引起CD95形成三聚体，诱导凋亡，这样的三聚化机理目前还不清楚^[9,10]。

2、CD95 的信号通路

     最早被发现的CD95和TNFR－1信号通路之一是激活酸性神经鞘磷脂酶（aSMase）并产生神经酰胺（ceramide），神经酰胺可能是细胞凋亡的中介分子。在细胞培养时加入一些脂类分子如C2－ceramide可以诱导凋亡。同时有报道酸性神经鞘磷脂酶对GD3神经节苷脂的产生很重要，GD3也是一种很重要的细胞凋亡的中介分子^[11]。

     在另外的一些研究中，人们发现这一信号通路可能并不是太重要：1，C₂－ceramide在低浓度下诱导凋亡不是直接作为凋亡的诱导者，而是通过上调CD95L来实现的。2，一些研究发现神经酰胺参与细胞凋亡不通过Caspase起作用。3，aSMase－/－大鼠和细胞系研究表明，CD95介导的凋亡仍然存在，不同之处在于aSMase－/－大鼠和细胞系对紫外线诱导的凋亡表现为部分缺失^[12,13,14]。所以，ceramide的产生可能是细胞凋亡的结果，而不是细胞凋亡的原因。

     另一个重要的CD95信号通路的显著特征是，当CD95L或其他配体与CD95结合，CD95三聚化并且同时产生一种称为DISC(death-inducing signaling complex)的结构。在双向电泳中发现，DISC由几种分子组成：1，寡聚化极可能是三聚化的CD95；2，丝氨酸被磷酸化的接头蛋白FADD/Mort-1；3，Caspase的两个异构体（Caspase－8a/flice/mach-α1/mach5β）和（Caspase-8b/mach-α2）；4，CAP3（cytotoxicity-dependent APO-1-asocited proteins）；5，一个未知蛋白，N端含有Caspase的DED和一个未知的C端^[15-18]。这些分子形成DISC的分子比例还不很清楚，但是它们之间的相互作用和相关的结构域已经研究的较为透彻。在酵母双杂交中，利用CD95胞内部分的DD区域作为靶，发现了几个不是DISC成分的蛋白分子，其中一个是丝氨酸/苏氨酸激酶，RIP（receptor-interacting protein）。在RIP－/－大鼠研究中发现，CD95诱导的凋亡没有受到影响，而TNF引起的NF－κB转录激活却被抑制，所以RIP可能参与了TNF－R1的信号通路，这将在后面提到^[19]。另一个蛋白是FAP－1（Fas-associated phosphatase-1），FAP－1在体内实验中可与CD95的C端结合，并且可以抑制Fas诱导的凋亡。但是在体内却没有发现FAP－1和CD95的结合^[20]。

     CD95的寡聚化使胞内的DD区形成一种构象，它可以与接头蛋白FADD的DD区结合，而后FADD的N端DED区就能与Caspase－8a/b前体蛋白和CAP3结合，对Caspase－8a/b前体蛋白进行切割，使它形成由2个P10和2个P18亚基组成的异源四聚体。成熟的Caspase是由两个分子量分别为10和20kD的亚基组成的异源二聚体，这两个亚基紧密结合在一起，从而形成一个催化结构域。对FADD敲除小鼠的研究发现，在胚胎发育到11天左右时，由于心脏发育和不正常出血而死亡，对FADD－/－成纤维细胞研究发现，细胞凋亡受到很大影响，所以FADD蛋白在凋亡中是一个重要的分子^[21,22]。

     在几乎所有的例子中，凋亡信号的执行都牵涉到Caspase。Caspase最初是在研究线虫发育过程中被发现的，它的编码基因是ced3。Caspase（cysteine-containing asp-ase）是由其结构和功能而得名的，目前有10种Caspase在人体内发现，它们都有一个含丝氨酸的活性位点，选择性切割在羧端含天冬氨酸残基的由四个氨基酸组成的结构。所有的Caspase都显示出极高的对大分子或多肽底物P1位置天冬氨酸残基的选择性^[23,24]。它们可以被分为三类：a，Caspase－1，－4，－5；b，Caspase－3，－7，－2；c，Caspase－6，－9，－8。在CD95诱导的凋亡中，Caspase－8扮演了重要角色，当Caspase－8前体蛋白通过自身剪切转变成活性形式，然后激活Caspase－3，Caspase－7，接着Caspase－3激活Caspase－6。Caspase－3，Caspase－6参与核的凋亡。在小鼠和人体内发现了一种称为CAD（caspase-activated Dnase）的蛋白，CAD存在于胞质中，并且与ICAD/DFF－45蛋白结合，这就阻止了CAD进入细胞核降解DNA。Caspase可以降解ICAD/DFF－45，这样就释放出CAD，使它能够进入细胞核降解DNA。这几种Caspase同时降解多种胞内蛋白，它们降解的蛋白包括：一、结构蛋白（actin，fodrin，Gas2，gelsotin，keratin18，lamins，plectin）；二、信号蛋白（cPLA2，cbl，Raf-1，Akt-1，D-4GDI，MEKK-1， PAK2/hPAK65，PITSLRE激酶，PKC Mst1，pP125FAK，P21-GAP）；三、DNA复制和转录调控蛋白（MDM2，Rb，SPEBPs1/2等）；四、DNA/RNA代谢调控蛋白（DNA-PK，hnRNP-C，PARP，DSEB/RF-C140，U1snRNP等）；五、其他一些功能蛋白（cyclinA2，Huntingtin，Presenilin1/2等）^[25,26]。