NEB 公司 Phototope® 化学发光系统
Phototope®化学发光系列试剂盒是专门设计用于非放射性方法检测核酸和蛋白的系统。作为传统的放射性同位素方法的代替，本方
法具有快速、敏感和经济的特点，其用途也越来越广泛，包括Southern杂交、Northern杂交、Western杂交、菌落杂交、噬斑筛选和热循环DNA测序等等。
Phototope®家族有以下产品：
NEBlot®Phototope®Kit：以随机引物法对DNA进行生物素标记，用于化学发光法Northern和Southern杂交。
Phototope®-Star Detection Kit：化学发光法检测Northern和Southern杂交。
Phototope®-HRP Western Blot Detection Kits：用辣根过氧化物酶／LumiGLO化学发光法进行Western检测。
以下对这些产品分别加以详细介绍。
NEBlot®Phototope®Kit (探针生物素标记试剂盒)
#7550 25reactions
本试剂盒以随机引物法合成生物素标记的探针，用于化学发光法Northern/Southern杂交。生物素有两种方式掺入杂交探针，①八碱基随机引物以生物素标记；②在引物延伸反应过程中，掺入生物素标记的dATP。
生物素标记的探针与固定于膜上的靶DNA杂交后，通过Streptavidin(链亲和素)-生物素偶联的碱性磷酸酶-碱性磷酸酶底物，把核酸杂交信号转化成化学发光信号。
Phototope®-Star Detection Kit
(CDP-StarTM 化学发光法检测Northern/Southern杂交信号)
#7020 Detection up to 20,000cm2 of membrane
本试剂盒是一种基于酶促反应的化学发光法检测技术，产生蓝色，显影在X-光片上。由于其敏感、方便、安全和成本低廉，已经取代放射性同位素在杂交实验中的作用。
该方法有四个基本步骤：
⑴.靶DNA固定于膜支持物上(如德国Schleicher & Schuell公司的SuperCharge尼龙膜)
⑵.加入生物素标记探针(如以上所述之NEBlot®-Phototope® Kit)是行杂交，并以Streptavidin亲和上目标DNA
⑶.生物素偶联的碱性磷酸酶结合于Streptavidin
⑷.加入碱性磷酸酶底物—CDP-Star™。碱性磷酸酶催化CDP-Star™发生裂解，产一不稳定中间物，并在461nm处发出蓝光，显影于X-光片上(1-10分钟)。
● Phototope 化学发光法优点
• 稳定：32P-标记的探针只能放置几天，而生物素标记的探针可放置较长时间
• 敏感：可检测哺乳动物DNA中的单拷贝基因(<1pg)
• 快速：整个检测程序只需40分钟(暴光时间只需5-10分钟)
• 多次暴光，以获取最佳信号强度
• 多重探测(reprobing)
● 用途
Northern杂交、Southern 杂交、噬菌体文库筛选、菌落文库(质粒文库)筛选
Phototope®-HRP Western Blot Detection Kit Detection for 5,000cm2 of membrane #7071 anti-Rabbit IgG #7072 anti-Mouse IgG
本试剂盒专门设计用于化学发光法Western杂交。蛋白质样本和生物素标记的蛋白分子量标准经SDS-PAGE后转于印迹膜上，然后经一抗→HRP 标记的二抗→HRP催化LumiGLO试剂发生反应并产生激发光→显影于X-光片上。
Phototope®-HRP化学发光法Western杂交有六个基本步骤：
⑴.SDS-PAGE电泳分离蛋白质样本和生物素标记的蛋白质分子量标准。
⑵.转膜。用常规电转法。
⑶.封闭。把膜上的非特异性结合位点封闭掉。
⑷.加入一抗温育。
⑸.加入HRP标记的二抗温育。
⑹.化学发光检测。加入LumiGLO试剂，并以X-光片捕捉HRP催化LumiGLO试剂所产生的激发光。
● 杂交膜 推荐用PVDF膜或硝酸纤维素膜。非常重要的是在整个实验过程中必须使PVDF膜始终保持湿润，在杂交转膜装置搭好前要预湿润PVDF膜，具体做法：100%甲醇浸泡3秒→去离子水浸泡10秒→转膜缓冲液中至少平衡5分钟。如果转膜前PVDF膜已经干燥，重复上述过程。另外，在转膜前要先将凝胶置于转膜缓冲液中平衡15分钟。
●优点
• 敏感。可检测pg级蛋白质。
• 快速。整个实验过程中不超过2小时。曝光时间从数秒到10分钟。
• 定量。
(http://www.ebiotrade.com/)
