定量PCR技术在多态性分析和突变检测中的应用

定量PCR技术是近年新发展起来的一项技术，它通过对荧光信号的检测实现了对PCR过程中产物量的实时监测, 并可以精确计算出PCR的初始模板量. 因此, 定量PCR技术可以广泛应用于临床上的病源体(如病毒, 支原体, 衣原体等)检测, 也可通过RT-PCR用于科研上表达差异的研究. 而且, 定量PCR技术在多态性分析和突变检测中也有广泛的应用. 

利用定量PCR进行突变检测和多态性分析的方法目前主要有两种, 一种是将探针或引物设计在待检测的突变区域, 利用定量PCR对初始模板定量; 另一种是利用定量PCR仪生成的熔解曲线(Melting curve). 

方法1 

对于一个含有单碱基多态性(SNP)的待测样品, 我们希望得到其各种多态性等位基因的比例或者说是频率, 就可以设计设计一系列的PCR引物, 其5’引物的3’末端分别与各个不同的等位基因配对(如下图)

等位基因1: 5’-ACGGTTGGCCCGCGTTCAGGGCT…………3’

等位基因2: 5’-ACGGTTGGCCCGCGTTAAGGGCT…………3’ 

5’引物1:      TGCCAACCGGGCGCAAC 

5’引物2:      TGCCAACCGGGCGCAAT  

假设相应于等位基因1的CT值为CT1, 相应于等位基因2的CT值为CT2, 
设 ΔCT = CT1-CT2
则待测样品中等位基因1的频率可用下式(1)计算
frenquency of allele1 = 1/(2ΔCT+1)         (1)

Germer et al [1] 用来源于人和小鼠的二十多种基因, 将其等位基因按已知比例混合, 然后用该方法进行检测, 结果吻合得非常好.(下图)

利用熔解曲线进行突变和多态性检测的方法已经用于Factor V [2], Methylenetetrahydrofolate reductase [3], Prothrombin G20210A [4], hemochromatosis [5]等基因的Genotyping.
这种方法主要用于采用FRET探针方法或Sybr Green 染料方法进行检测的定量PCR仪．以前者为例，其原理如下图所示

Probe 上含有待检测的SNP位点，熔解曲线实际就是它与模板链间解链程度与温度的关系图．Probe 如果有错配，其熔解曲线的峰值会显著向低温方向移动．（如下图）　因而可以通过熔解曲线的峰值位置检测突变情况．

总的来说，与其它方法如测序, DHPLC, 基因芯片相比，定量PCR用于突变和多态性检测对仪器要求较低，操作简单，速度也较快．不足之处是只能用于已知突变位点的Genotyping,而不能进行未知突变的寻找．

Reference
[1] Germer, et al Genome Research 258-266
[2] Lay M J. Wittwer C J. Clin Chem 1997. 43: 2262-7
[3] Bernard P S, et al Anal Biochem 1998. 255:101-7
[4] Von Ahsen N, et al Clin Chem 1999. 45:694-6
[5] Bernard P S, et al Am J Pathol 1998; 153:1055-1061
[6] Von Ahsen N, et al Clin Chem 2000. 46:156-161