凋亡蛋白：特异性触发肿瘤细胞死亡的蛋白质
王建华 陈诗书
(上海第二医科大学分子生物学实验室、人类基因治疗研究中心，上海200025)
凋亡蛋白(apoptin)是近年来发现由鸡贫血病毒(CAV)vp3基因产生的蛋白质，主要引起鸡淋巴细胞凋亡[1、2]。进一步研究发现，凋亡蛋白具有一种抗肿瘤细胞特异性，即仅仅诱导肿瘤细胞或转化细胞凋亡，而对正常细胞或二倍体细胞不起作用。更让人感兴趣的是，凋亡蛋白诱导的凋亡不依赖功能性P53的生成，也不被BAG-1、Bcr-abl的生成所抑制，甚至不受凋亡抑制因子Bcl-2过分产生的影响[3、4]。这些特性预示，凋亡蛋白可被用作一种治疗因子，只要它在体内能被大量传递给肿瘤细胞，就可选择性地将它们根除。这一诱人的基因治疗策略超越了目前所有基因的治疗方法，可能会给肿瘤的基因治疗带来广阔前景。
1. CAV基因组中vp3片段的功能和特性
对vp3基因片断的研究最初是从分离到的CAV开始的。CAV是由Yuasa等在调查Marek疾病流行时首先分离，它主要引起雏鸡严重贫血，皮下和肌肉溶血，破坏骨髓内有核红细胞，耗损淋巴器官(特别是胸腺小叶)。CAV颗粒平均直径约23.5~25nm,含有一个分子量约50kD的主要衣壳多肽，核酸为单链环状DNA。Noteborn等[1、2、4、5]发现，完整的CAV
DNA约长2319nt，DNA正链上有3个部分重叠的ORF，即：vp1、vp2、vp3，分别编码分子量为516000、24000和13600的多肽。50kD的主要衣壳多肽就是由最大的vp1所编码。计算机序列分析显示，这些ORF编码的蛋白质的氨基酸顺序与那些已知的病毒和细胞蛋白质没有任何同源性。CAV基因组可能含有仅仅一个启动子和一个poly(A)附加信号。
Noteborn等深入研究了CAV感染细胞的免疫学特性，发现CAV引起鸡胸腺细胞、转化的单核细胞、鸡有核红细胞的病理效应是通过凋亡实现的。在纯化的CAV颗粒中，没有VP3蛋白，而在CAV感染的细胞中，VP3蛋白似乎对病毒的生命周期十分重要。结构分析显示，VP3蛋白是由121个氨基酸组成，具有2个富含脯氨酸序列和2个正电荷区。为进一步研究VP3蛋白的功能，Noteborn等利用抗VP3蛋白的特异性抗体MAbs3B1和MAbs
85:1，在几个时间点用免疫组化法染色CAV感染的MDCC-MSB1细胞，发现CAV感染后24小时，核内出现与MAbs
85:1结合的VP3蛋白，呈微弱细颗粒状分布，以后，颗粒逐渐增大，逐渐聚集在一起，在感染后64小时形成十分明显的聚集体，此时呈现清晰可见的CAV诱导的特异性细胞病理效应。免疫电镜观察到，在CAV感染的细胞核中，MAbs3B1与许多电子密度样凋亡的结构紧密结合。显然，这是VP3蛋白在这些凋亡结构中的聚集。为明确是否仅由vp3基因就可诱导细胞凋亡，Noteborn等构建了仅表达vp3基因的pRSV-vp3载体用以转染鸡有核T淋巴细胞，发现48小时后约60%感染细胞的核内有VP3细颗粒，有这种VP3的细胞DNA可被PI(一种染色完整细胞核的染料)清晰染色，呈现凋亡特异性阶梯状条带，而对照(转染有质粒pRSV-tr或pRSV-CAT)的MDCC-MSB1细胞中DNA没有此种条带。在仅表达VP3蛋白的一些其它类型鸡细胞中，也得到同样结果。Noteborn等根据VP3蛋白具有诱导细胞凋亡的功能，将其命名为凋亡细胞(apoptin)。
2. 凋亡蛋白的抗癌特性
实现凋亡蛋白基因治疗的首要步骤是构建它的表达载体。Noteborn等应用重组缺陷性腺病毒(rAdV)与CAV
vp3基因片段成功地构建了能产生凋亡蛋白的载体AdMLPvp3和对照病毒载体AdMLPas。鉴于构建的腺病毒载体在释放后具有明显的嗜肝性，所以把AdMLPvp3和AdCMVlacZ(充当对照作为细胞死亡的背景值)分别感染原发性鼠肝癌细胞和人肝癌细胞Hep3b及HepG2(不考虑其相应的P53功能)以研究腺病毒介导的基因转移所具有的抗肿瘤特性。他们发现，产生凋亡蛋白的肝癌细胞约有70%~80%死亡，而表达二种基因的原发性鼠肝细胞的死亡率没有显著差异。把AdMLPvp3和AdCMVlacZ分别转染到角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、T细胞、鳞癌细胞(VH10)、骨肉瘤细胞(U20s、Saos-2)、人白血病细胞(KG-1、K562、DOHH-2)后，也得到相似结果。这表明肿瘤细胞或转化细胞对AdMLPvp3表达的凋亡蛋白具有很高的敏感性，而对正常细胞不起作用。Pietersen等[4]分别用酶免疫荧光分析(DAPI)和(TUNEL)分析，观察
AdMLPvp3或AdCMVlacZ感染的HepG2细胞DNA链断裂情况和产生凋亡蛋白的细胞数，证实体外AdMLPvp3感染HepG2细胞引起的杀伤效应是通过凋亡途径实现的，在感染其它肿瘤细胞所诱发的死亡中也得到同样结果。
Pietersen等对AdMLPvp3可能存在毒性效应进行了研究。对健康鼠分别以皮下、腹膜、和静脉三种不同方式注射2×109pfu
AdMLPvp3、AdMLPas或生理盐水，结果病毒转染组与生理盐水对照组一样对肝细胞无明显损伤，同时用显微镜观察心、肺、脾、皮肤、睾丸等组织，也未发现有明显的病理变化。大剂量AdMLPvp3转染动物后，也未观察到明显的毒副作用。
在肿瘤治疗中，许多化学治疗性复合物和同位素辐射是通过野生型P53诱导肿瘤细胞凋亡的，虽然，其中有些也可以经非P53方式诱导，但大数肿瘤在其发展中却往往发生P53突变，从而影响治疗的效果。所以，寻求不依赖野生型P53的特异性抗癌因子，一直是人们关注的问题。Zhuang等[6、7]利用可表达不同P53状态的骨肉瘤细胞系(产生野生型P53的U20s细胞，不产生P53的Saos-2细胞和产生突变型P53的Saos-2和ala143细胞)研究凋亡蛋白的抗癌效应时，发现这些细胞都对凋亡蛋白诱导的凋亡有相同的敏感性，表明凋亡蛋白诱导肿瘤细胞凋亡过程并不涉及到产生野生型P53的过程。此外，Zhuang等[3、7、8]还发现，凋亡蛋白诱导的凋亡也不受抑制性凋亡因子Bcl-2、Bcr-abl和一种与Bcl-2相关的蛋白BAG-1生成的影响。为进一步证实这种不依赖P53的方式并不是Saos-2细胞所特有的，Zhuang等研究了凋亡蛋白在P53阴性的人肝癌细胞Hep3B中的生成效应，发现凋亡蛋白可同样有效地诱发这种细胞凋亡。
虽然，凋亡蛋白在体外对肿瘤细胞或转化细胞有明显的杀伤性，但它在体内的产生是否有同样的效应令人关注。Pietersen等在无胸腺小鼠皮下两侧各注射人肝癌细胞HepG2，然后在成瘤后的瘤体处各注射AdMLPvp3、AdMLPas或生理盐水，发现注射AdMLPvp3的小鼠肿瘤与注射生理盐水和AdMLPas的相比，生长明显减慢、生长率也明显降低，并且注射AdMLPvp3的肿瘤在显微镜下显示外观苍白，含囊泡样结构，组织检查显示其瘤体中血管组织很少，可能与凋亡蛋白在诱导凋亡的过程中降低了刺激血管产生的因子有关。凋亡蛋白在体内对其它肿瘤的杀伤效应和相关临床前期治疗研究，目前正在进行中。
3.凋亡蛋白抗癌的机制问题
关于凋亡蛋白诱导凋亡的机制，有一点已研究得十分清楚，就是没有涉及凋亡信号转导途径的上游胱天蛋白酶，而下游胱天蛋白酶的作用似乎更重要。初步研究未发现凋亡蛋白的氨基酸顺序与介导凋亡的受体或c-myc和P53等诱导凋亡的癌基因产物的顺序有任何显著同源性，所以凋亡蛋白不大可能具有后者的活性。凋亡蛋白是否通过与膜结合受体相联以诱导凋亡？凋亡蛋白位于核内的发现排除了这种可能。计算机分析也没有显示凋亡蛋白与任何一种已知的内切核酸酶有顺序同源性，从而否定了这充当内切核酸酶的可能性。免疫分析发现，在转化细胞和肿瘤细胞中，在其出现典型的凋亡形态以前，凋亡蛋白主要以细颗粒状分布在核内。细胞经历了凋亡后，凋亡蛋白则聚集在核内。而在正常细胞中，凋亡蛋白主要分布在胞质中，集中环绕在核周围，以小颗粒状和大块状分布。是什么原因导致这种凋亡蛋白分布位点的差异？至今还没有定论。有人认为，可能是在转化细胞中由于功能性抑制剂被转化，使得它们的运输系统改变，由于这些变化，导致肿瘤细胞中蛋白质的核运输被抑制。但一般认为，在正常细胞中，凋亡蛋白常结合一个或几个功能性因子或被其修饰，导致凋亡蛋白位于核结构周围，而在转化或肿瘤细胞中，由于丢失了这些功能性因子，从而可使凋亡蛋白进入核内。研究证实[8]，在凋亡蛋白的锚定处不仅含有二个公认的核进入顺序，而且还含有一个与核输出信号相似的氨基酸区域——与蛋白激酶抑制物和HIV-Rev蛋白的相应区域类似，可能许多转化细胞和肿瘤细胞不能识别这种潜在的核输出信号，因而造成凋亡蛋白在核内的聚集。
不管怎样，凋亡蛋白位于核内是它诱导凋亡的关键所在。截短的凋亡蛋白(剔除C末端基本区域)其活性显著降低，原因是此种凋亡蛋白缺少一段公认的核定位信号，因此运入核内的效率下降。但截短并没有使其诱导凋亡的活性完全丧失，只是降低了诱发凋亡的比率。电镜下观察到，小分子的凋亡蛋白很容易与染色质结构中的组蛋白或非组蛋白结合，在阉割后小鼠的胸腺细胞和腹部前列腺细胞中，这些经过修饰的染色质结构引发细胞DNA分子超螺旋结构的干扰可能主要是由于它的结构中富含脯氨酸，使其充当转录性调节因子，诱导介导凋亡的基因表达。另有研究认为，凋亡蛋白可直接与连接在核小体DNA分子间的组蛋白H1结合，激活内切核酸酶，使核小体DNA降解。也有研究认为，凋亡蛋白诱导凋亡可能是通过直接或间结途径激活癌基因c-myc、P53或Fas-L的表达，或是充当抑制剂抑制癌基因Bcl-2的活性。总之，在凋亡蛋白诱发肿瘤细胞凋亡的确切机制弄清之前，这些研究结果都有待进一步证实。
目前，肿瘤的基因治疗受到特异性的限制，尽管人们通常通过对肿瘤细胞靶向特异性载体、肿瘤特异性表达转基因或局部给与基因转移载体等方法提高对肿瘤治疗的特异性，但实效不大。用CAV中vp3基因片段构建AdMLPvp3载体所表达的凋亡蛋白对肿瘤细胞的特异性杀伤功能令人鼓舞。并且，凋亡蛋白在体内表达的低毒性和机体较好的耐受性使得可重复较大剂量转染，提高凋亡蛋白在核内的浓度，从而提高治疗效果。更值得关注的是，凋亡蛋白诱导肿瘤细胞凋亡与这些细胞表达的P53、Bcl-2和Bax状态无关。这一切显示了凋亡蛋白在肿瘤治疗中所具有的巨大潜力，深入研究可望一开辟一条崭新的抗肿瘤途径。
参考文献：
1. Noteborn MH et al. J Virol, 1991, 65, 3131
2. Noteborn MH et al. Gene, 1992, 118:267
3. Reed JC. J Cell Biol, 1994, 124:1
4. Pietersen AM et al. Gene Therapy, 1999, 6:882
5. Noteborn MH et al. J Virol, 1994, 68:346
6. Zhuang SM et al. Cancer Research, 1995, 55:486
7. Zhuang SM et al. Leukemia, 1995, 9(suppl 1):118
8. Danen AM et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:5843
最新招聘信息：