PSQ 96 DNA分析系统成为基础医学研究和临床分子诊断的强有力的工具[创新技巧]

一、 PSQ 96 DNA分析系统与临床分子诊断:

    PYROSEQUENCING公司于今年成立了分子诊断学事业部，并与一些著名大学/研究单位合作，利用PSQ 96 DNA分析系统，进行一些重要疾病的分子机理研究，研究和开发疾病的临床分子诊断技术平台，包括法医鉴定。这些研究基于DNA序列分析/SNP分析/等位基因频率确定。这些研究与开发为:

(一) 病原微生物:
   1.和The Cleveland Clinic Foundation合作研究引起肺结核等疾病的分支杆菌(mycobacteria)的快速鉴定方法。

   2.和the Scottish Meningococcus and Pneumococcus Reference Laboratory， Stobhill Hospital，Glasgow，Scotland合作研究引起脑膜炎和败血病的细菌Neisseria meningitidis (N.meningitidis)的快速精确的鉴定和分型，包括SNPs和short sequence stretches。

   3.和Clinical Bacteriology， Uppsala University， Sweden合作研究幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)， 肺结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和炭疽热细菌(Bacillus anthracis)的快速鉴定和检测及细菌耐药性。值得注意的是，发布这次合作的时间是今年7月10日，是在911事件之前两个月。

(二) 突变检测和诊断开发
    和The Children’s Hospital of Philadelphia合作研究听力损失相关基因Connexin 26等的突变和开发诊断方法。

(三) 药物研发
    和Genomics Collaborative， Inc。 (GCI)合作研究心血管疾病和药物反应，发现和确认心血管疾病相关基因的遗传标记如SNPs。 PYROSEQUENCING获得一项专利(U.S. Patent No.6，197，505)，内容为评估心血管情况(包括心肌梗塞和中风)的方法，涉及与心血管疾病相关的基因的SNPs图谱[这些基因为:血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)，血管紧张素(angiotensin，AGT)，血管紧张素II的I型受体(angiotensin II receptor type I，AT1)]，以及利用SNPs预测人体对诸如抗高血压药物的反应(这些药物有ACE抑制剂如captopril和血管紧张素受体激动剂如losartan)。

(四) 和the University of Geneva合作，开发唐氏综合症[Down Syndrome (trisomy 21)]快速精确经济的诊断方法和分析相关基因。

(五) 和Pel-Freez Clinical Systems， LLC合作，评估和开发人类白细胞抗原[Human Leukocyte Antigens (HLA)]分型方法。

二、利用PSQ 96 DNA分析系统，基于DNA序列测定的炭疽热细菌Bacillus anthracis的菌种鉴定及其致病力鉴定

    土壤细菌Bacillus anthracis (B.anthracis)是引起炭疽热严重感染的病原细菌。从接触病原体到症状最初出现的感染发展过程一般为1到6天。如果确认受到B.anthracis攻击，利用抗生素或解毒剂可以防治其感染，因此快速鉴定病原微生物种类和其致病力状态具有很重要的意义。在起初24-48小时内摄入抗生素可以防治其传染。抗体检测的诊断方法可能比病情进展稍微滞后，而在这个时期的防治可能是失败的。

    被称为Ba813的一段DNA序列是B.anthracis的一个特异染色体标记，是B.anthracis区别于与其紧密相关的其他土壤杆菌种的标志。 Ba813长度为277bp，在染色体上为单拷贝。 16S rRNA基因的序列分析被用于细菌分型，但不能用来分析B.anthracis，因为B.anthracis与B.cereus具有一样的16S rRNA序列。

    B.anthracis的致病菌株有两个质粒，pXO1含炭疽热毒素产生的基因( lef，cya，pag)。 pXO2编码包装和孢子形成所必须的产物。目前，通过DNA杂交来检测这些特异致病因子是鉴定B.anthracis的主要手段。然而由于缺少一个或两个质粒的非致病菌株可能来自致病菌株，因此此方法即不完全可靠又不快速。其他费时的方法包括gamma phage sensitivity tests和carbohydrate profiles。

    本研究试图建立新的鉴定B。 anthracis及其致病状态的方法，即利用Pyrosequencing™技术分析PCR扩增的Ba813的20bp的序列来鉴定B.anthracis，并通过分析lef和位于pXO2的cap的基因序列来确定B.anthracis的致病状态。

    提取B.anthracis的质粒和染色体DNA，设计三对引物，分别扩增Ba813中的129 bp， lef基因的177 bp， cap基因的127 bp。每对引物的其中一条用生物素标记。

    采用streptavidin coated beads (Streptavidin Sepharose™ HP， Amersham Biosciences AB， Sweden)和PSQ™ 96 Sample Preparation Kit (Pyrosequencing AB) 及其相关方法将PCR双链分离，转移至PSQ 96 SQA Plate的含生物素引物的单链PCR产物和测序引物退火。

    利用测序试剂盒SQA Reagent Kits (Pyrosequencing AB)和PSQ 96 DNA分析系统进行序列分析，结果用SQA软件进行分析。

    通过对来自the Swedish Defence Research Agency的13个B。 anthracis分离物的Ba813的20bp片段的序列分析，其中12个分离物被明确鉴定为B.anthracis (Table 1， Fig.1)，另外一个由于PCR的失败而被排除。同时也检测了质粒(Table 1， Fig.2-3)。 SQA软件精确分析了11个分离物的核苷酸序列(大于等于20bp)。其中一个序列的AA被错读为AAA，但这并不影响对细菌的鉴定。菌株鉴定的序列分析的精确度为99.6% (Table 2)，而致病力鉴定的序列分析的精确度为100% (Table 2)。

    因此，利用PCR和Pyrosequencing™技术的序列分析提供了一个可靠的鉴定Bacillus anthracis及其致病力的快速简单的方法。与其他方法相比，此方法速度快，几个小时出结果，而且结果精确。

References
1. Ramisse，V. et al. Identification and characterization of Bacillus anthracis by multiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXO1 and pXO2 and chromosomal DNA. FEMS Microbiol. Letters 145 9-16 (1996).
2. Cieslak， T.J. and Eitzen Jr， E.M. Clinical and epidemiologic principles of anthrax。
Emerging Infect. Dis. 5(4) 552-555 (1999.
3. Turnbull， P.C.B. et al. Bacillus anthracis but not always anthrax. J.Appl.Bacteriol.
72 21-28 (1992).
4. Boom， R.et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J.Clin.
Microbiol. 28(3) 495-503 (1990).



三、PSQ 96 DNA分析系统与基础医学研究:

    后基因组时代的主要任务是揭示基因的功能，其中基因的SNP分析是主要方向之一。目前很多机构在进行大规模SNP的普查并将结果递交到公众数据库，这其中很多SNP究竟如何影响了基因功能的问题并没有解决。SNP发现后研究SNP与基因功能的关系是最主要的目的，而首先需要解决的问题之一是确定特定SNP在特定人群(或其他生物)的序列资料和在特定人群(或其他生物)中的分布几率，特定人群的划分标准可以是家系，民族等。

    在特异基因SNP和疾病关系/性状研究中，科学家利用PSQ 96系统对DNA进行序列分析/通过序列分析证实SNP/通过序列分析进行等位基因频率确定。这些研究包括:

进行性外眼肌麻痹 (Progressive external ophthalmoplegias， PEO) 和线粒体DNA聚合酶 (mtDNA polymerase ，POLG) [ Gert Van Goethem et al， Nature Genetics 2001， 28: 211-212]，

自身免疫紊乱-多发性硬化症 (multiple sclerosis， MS) 和CD45 [Igor Vorechovsky et al， Nature Genetics 2001， 29: 22-23]；

多发性骺发育不良 (Multiple epiphyseal dysplasia) 和Matrilin-3的von Willebrand因子A结构域 [Kathryn L.Chapman et al， Nature Genetics 2001， 28: 393-396]；

骨胳肌糖原含量增高与猪肌肉特异性的腺苷单磷酸激活的蛋白激酶 (adenosine monophosphate–activated protein kinase，AMPK) 异构体的调节亚单位 [Denis Milan et al，Science 2000，28）