重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中分泌表达影响因素的研究

«生物工程学报»2000年11月16卷6期

¹  黄 鹤¹  章如安¹  钱美琴²  余有浩³  钱雪明¹  袁中一^1
1(中国科学院上海生物化学研究所    上海    200031)
²(上海第一生化药业公司    上海    200080)
³(上海大学生物工程系    上海    200180)

摘  要  为获得高产稳产重组人血清白蛋白的Pichia pastoris细胞株用于高密度发酵，构建了多种分泌表达载体，在Pichia pastoris中作表达，研究表达载体构建等因素对表达量的影响。发现采用酿酒酵母α性成熟因子前导肽比人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽的表达量要高10%左右。而载体整合方式、整合拷贝数、5'非翻译区的改造和甲醇利用表型等对表达量无规律性影响。筛选到的高表达株经高密度发酵，细胞湿重达460 g/L，发酵液上清的人血清白蛋白含量为1.0 g/L。

关键词  重组人血清白蛋白，Pichia Pastoris, α性成熟因子前导肽，高密度发酵

中图分类号  Q789        文献标识码  A      文章编号  1000-3061(2000)06-0675-04

    人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)在体内起着维持血液渗透压、运输营养和保护其他重要生物物质作用。临床医疗中用于手术输血和危重病人补液，治疗烧伤休克、发烧、水肿，低蛋白血症(Hypoproteinemia)和红细胞过多症(Erythroblastosis)等，是重要药物^[1]。

    市售HSA均来自人血清抽提。然而人血来源有限，加上艾滋病及肝炎的蔓延，更威胁人血制品的安全性。显然，通过基因工程手段，改变HSA的传统生产途径，以重组细胞生产HSA已十分必要了。

    目前，HSA在Pichia pastoris中表达工作领先的是Research Corp. Tech Inc. (RCTech)和Green Cross Inc./Yoshitomi Pharmaceutical Inductries, Ltd.虽然，RCTech取得了3.39 g/L的单罐表达水平纪录^[2]，但是在HSA的大规模生产应用上，Green Cross走在了前头。

    Green Cross公司生产的重组HSA已通过III期临床试验，并于1997年10月开始申请将重组HSA用于白血病治疗的生产许可(GB-1057)。如今，其母公司Yoshitomi公司正在日本的Hokkaido兴建大规模的重组HSA生产设施，计划在2000年中投产^[3]，并已准备打入中国市场。由于重组HSA的生产技术事关巨大的商业利益，有很多关键技术和数据都没有公开，需要我们自己探索以生产有自主知识产权的重组HSA产品。

    我们构建了重组人血清白蛋白多种表达载体，在Pichia pastoris中作了小规模表达试验和发酵研究。

1   材料和方法

1.1  材料

    大肠杆菌XL1-Blue, TG1由本实验室保存。克隆质粒为pUC18和pBluesript SK (+)。Pichia pastoris GS115,KM71表达宿主细胞，Pichia pastoris整合表达质粒pPIC3.5K,pPIC9,pPIC9K和pAO815来自Invitrogen。载有hsa基因的M13mp18由中国科学院上海生物化学研究所戚正武教授提供。所用引物由Sangon合成。限制酶，Taq聚合酶，T4 DNA连接酶，Geneticin (G418)购自Gibco BRL。兔抗人血清白蛋白抗血清由本实验室制备，HSA购自上海市中心血站。随机引物标记试剂盒购自Takara。杂交尼龙膜购自Boehringer Mannheim。其他试剂均为国产或进口分装分析纯。

1.2  方法

1.2.1  有关Pichia pastoris的实验方法：根据Invitrogen Pichia Expression Kit进行。小规模表达方法同以前报道^[4]。发酵参照Pichia Fermentation Guideline进行。其他根据分子克隆实验指南进行。DNA序列测定由皓嘉公司自动测序仪完成。T载体根据Marchuk等^[5]的方法以pBluescript SK(+)制备。PCR条件参照Gibco BRL的Taq Polymerase说明书。PCR产物以T载体克隆并测序验证。DNA定量点杂交根据Invitrogen Pichia Expression Kit Version J进行。杂交用DNA探针以hsa基因为模板利用Takara随机引物标记试剂盒合成。

1.2.2   质粒构建：将M13mp18上的hsa基因用EcoRI和BamHI切下，装入pUC18中(pUC18-hsa)。将pUC18-hsa上的hsa基因用EcoRI和BamHI切下，装入Pichia表达载体pPIC3.5K中，得pPIC3.5K-hsa。以pUC18-hsa为模板，用引物1：5'-GTCTCGAGAAACGAGATGCACACAAGAG-3'和M13/pUC反向测序引物扩增hsa基因，PCR产物克隆到T载体中，以EcoRI和XhoI切出，装入pPIC9中，得pPIC9K-hsa。以pPIC9-hsa为模板，用引物2:5'-TTCGAAACGATGAGATTTCCTT CAATTTTTACT-3'和3'aox1引物扩增hsa基因，克隆到T载体中，以NspV和EcoRI切下hsa基因，装入pAO815中，得pAO815-a-hsa。以pUC18-hsa为模板，用引物3：5'-TTCGAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTC-3'和M13/pUC反向测序引物扩增hsa基因，克隆到T载体中，以NspV和EcoRI切下hsa基因，装入pAO815中，得pAO815-hsa。将pPIC3.5K-hsa,pPIC9-hsa,pPIC9K-hsa,pAO815-hsa和pAO815-a-hsa以SacI线性化并电传化到Pichia pastoris GS115和KM71中，pPIC9-hsa还以salI线性化电转化至Pichia Pastoris GS115中，得到共11种重组细胞，每种各挑取20～50个转化子进行小规模表达。

1.2.3  高密度发酵(培养基的详细配方参见Pichia Fermentation Guideline):从YPD平板将筛选得到的GS115(pPIC9-hsa)高表达株接种至3 mL YPD培养基中，30ºC，300 r/min培养至A₆₀₀=2～6。另配置6L含4%甘油的无机盐基本培养基，在B.Braun-E全自动12L发酵罐中灭菌。街罐温冷却至30ºC后，用氨水调节pH至5.8，加入26 mL PTM₁ Trace salts溶液，将种子培养液接种至发酵罐中，通气量为0.5～2 vvm。保持溶氧为30%左右，搅拌转速为300～800 r/min。待甘油消耗完后(溶氧上升)，流加70%甘油(每升含PTM₁ Trace salts溶液12 mL，流速30 mL/h)至细胞湿重达100～200 g/L)。停止流加甘油，溶氧升至100%后再饥饿0.5～1 h，流加甲醇(每升含PTM₁ Trace salts溶液12 mL,流速18～20 mL/h)诱导72～150 h后放罐。

2    结果和讨论

    经DNA测序，威尔武教授提供的hsa基因全序列详见Genbank AF190168。与国外发表的hsa序列基本相同，只是推导得到的preproHSA氨基酸序列中的122位精氨酸和466位谷氨酸分虽变为丝氨酸和甘氨酸。
    GS115(pPIC9-hsa)的表达从图1可见培养液上清中的HSA在SDS-PAGE电泳谱上呈67 kD一条带，但往往会在45 kD处出现HSA的片段。这与Sleep等^[6]在酿酒酵母中表达HSA的结果相似。然而，我们发现以MFα-1 prepro作为前导肽并没有导致45 kD的比例增加。这与Sleep等在酿酒酵母中表达HSA观察到的不同。但不同的表达批次之间，45 kD条带的比例相差较大(见表1)。说明45 kD的比例受培养条件的影响更大。Sleep等的研究表明45 kD片段在酿酒酵母内即已形成，与内肽酶切点无关，而且也不是由于低频密码子引起翻译的终止^[3]。从HSA的晶体结构分析，45 kD断点在空间位置上并无期明显的特殊性。因此，45 kD片段的形成机理还有待进一步研究。

图1    GS115(pPIC9-hsa)发酵液上清的SDS-PAGE电泳图谱

    分别以SacI和SalI线性化整合到GS115中所得的两种重组细胞各挑取50个转化子，均能表达HSA，且两种细胞平均表达水平相近。表1列举了两种前导肽对HSA表达的影响，采用MFα-1 prepro作为前导肽的GS115 (pPIC9K-hsa)表达量比采用HSAprepro的GS115 (pPIC3.5K-hsa)表达量平均要高20%左右。为了排除5'非翻译区的影响，我们又构建了5'非翻译区和AOX1的5'非翻译区完全相同的表达载体。5'非翻译区的优化并没有如Sreekrishna等^[7]报道那样，使HSA的表达量显著提高。但5'非翻译区改造前后HSA的表达量表明了：MFα-1 prepro作为前导肽的菌株表达量高于HSA prepro作为前导肽的菌株。因此我们认为以MFα-1 prepro作为前导肽可能对提高HSA的表达量会更有利，但并没有如Davis所报道的那样比用天然肽要高2～3倍^[8]。但是为何其他研究者却并没有采用MFα-1 prepro，其原因值得深究。是否是MFα-1 prepro会造成成熟HSA氨基端加工的不均一?我们将要进行的纯化和N端测序工作将能回答这一问题。

    拷贝数对取得最高表达是一个极为重要的因素。有些情况下，单拷贝已经足够，醇氧化酶的基因能产生占总mRNA 5%的转录量，表明单拷贝的表达盒能产生高水平的mRNA。而实际上大多数单拷贝外源基因的mRNA远低于AOX1 mRNA的水平。其中一个主要原因是外源mRNA不如AOX1的稳定。对于分泌表达，倾向于选择最适的拷贝数而不是越高越好。Davis等的结果是含2拷贝hsa基因的转化子比单拷贝的表达量提高1倍^[8]。而Sreekishna的结果相反，单拷贝的转化子表达量为1 g/L，而2拷贝的转化子表达量为0.754 g/L,2拷贝以上的表达量就只有0.185 g/L了^[2]。我们的结果表明hsa的基因拷贝数与表达量的关系规律性不强。图2中的A2拷贝数高达10以上，但表达量并不高。其中表达较高的反而是D3和D5，而D5的拷贝数明显较低，约为2.GS115 (pPIC9K-hsa)的表达结果也表明一个拷贝数为3的转化子取得了最高表达。甲醇利用表型对HSA的表达量没有显著影响(表1)。将hsa表达载体转化到蛋白酶缺陷的宿主细胞(SMD1168)也未能使HSA的表达量提高(结果未发表)。我们在Pichia pastoris表达株的筛选时还发现，表达株的株间差异较大。即使是同一表达载体的同一批转化子，它们之间的表达量也会有较大差异，造成这一现象的原因不明。同时，有必要对所得的高表达株进行基因水平的分析来获得对Pichia pastoris这一表达系统的更深了解。

    我们在GS115 (pPIC9-hsa)表达株中挑取100个转化子作了表达，得到的第43号转化子表达量较高而且很稳定，43号表达株在优化条件下可以获得200 mg/L的表达量，比我们以前报道^[4]的更进了一步，超过国外的最高报道160 mg/L^[9]。

图2    GS115(pPIC3.5K-hsa)的DNA定量点杂交

A1 is the control strain GS115 (pPIC3.5K), others are transformants from G418 plate. Line 6 and 7 are single-copy transformants. Other dot blots can then be qualified for copy number by densitometry of the film.

表1  以不同前导肽在Pichia pastoris中分泌HSA的表达量比较
Table 1  Secretion of HSA from Pichia pastoris directed by different leader sequence

Vector	pPIC3.5K-hsa	pPIC9K-HSA	pAO815-hsa	pAO815-α-hsa
Lead sequence	HSAprepro	MFα-1 prepro	HSAprepro	MFα-prepro
Methanol utilization type	Mut+   MutS	Mut+   MutS	Mut+    MutS	Mut+    MutS
HSA amount in supernatant (mg/L)	75       70	90       100	80        80	90         90
The percentage of 45 kD HSA fragment (%)	0~15	0~14	0~13	0~18

Mut⁺, methanol utilization plus (obtained by using GS115 as host strain);
Mut^S, methanol utilization slow (obtained by using KM71 as host strain)

    发醇罐中高密度发酵的初步结果见图3。经170 h发酵(诱导期138 h)细胞湿重达到460 g/L，上清中HSA浓度达1.0 g/L。我们的小规模表达结果已超过国外报道的最高值160 mg/L。由于摇瓶中的表达条件和发酵罐中相差很大，在摇瓶培养中Pichia pastoris表达外源蛋白的水平往往不能准确反映其在发酵罐中的真实表达情况，我们最关注的还是发酵罐中的表达情况。国内目前尚无Pichia高密度发酵表达重组HSA的报道，国外有报道的一般为1 g/L，单罐最高为3.39 g/L，但诱导期长达10d。我们取得的初步结果也达到138h稳产1 g/L，不亚于国外水平。从摇瓶结果看，我们获得的表达株在发酵罐中的表达量应还有进一步提高的潜力。
    我们将来的工作将会注重于缩短高密度发酵的生产周期提高生产率。中力争上游，发酵工艺还应根据下游纯化工艺的需要以及生产总成本的控制加以改进。如Green cross就不仅仅简单地追求HSA表达量，还加上了产品着色度这一指标。他们的一篇专利就是有关在发酵罐中加入活性碳类物质吸附色素以减轻纯化工作负担^[10]。这些都是我们在发酵工艺的确立时应该引起注意的。

图3  重组HSA在Pichia pastoris中的发酵曲线

Cell growth HSA

参考文献

[1]   Goodey A R. TIBTECH,1993, 11:430~433
[2]   Sreekrishna K, Tschopp J F, Thill G P et al. US Patent 5,707,828, 1998
[3]   Kobayashi K, Nakamura N, Sumi A et al. Therapeutic Apheresis,1998,2(4):257~262
[4]   邱容德，李士云，陈俊刚等。生物化学与生物物理学报，2000,32(1):59~62
[5]   Marchuk D,Drumm M,Saulino A et al. Nucleic Acid Research, 1991,19(5):1154
[6]   Sleep D,Belfield G P,Goodey A R. Bio/technology,1990,8:42~46
[7]   Sreekrishna K,Barr K A, Hoard S Aet al. 15^th Int Congr on Yeast Genetics and Molecular Biology, Hague, The Netherlands, Topic No 09-37B.,1990
[8]   Davis G R. WO 92/13951,1992
[9]   Hayasuke N,Nakagawa Y,Ishida Y et al.US Patent 5,503,993, 1996
[10]  Ohmura T,Sumi A,Ohtani W et al.US Patent 5,294,699,1991