生物芯片(DNA微阵列)荧光扫描仪中的激光共聚焦扫描技术(下)[创新技巧]

【字体: 时间:2001年07月05日 来源:

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* 检测荧光扫描仪的探测器
    将微弱的荧光信号转化为电信号,在微阵列扫描仪中的光线探测器有:光电倍增管、CCD点阵探测器、雪崩光电二极管。各种装置有其优点也有其缺点。不同检测范围的仪器要根据它们各自的特点来选择合适的探测装置。光电倍增管在可见光波范围内是最灵敏的探测器,它属于单点探测器并要求扫描系统对微阵列上的样品进行空间定位,通过改变电压可以很方便地改变光电倍增管的灵敏度。光电倍增管的灵敏度在红外及近红外波长范围内降低得很快,所以它们的用途主要限制在可见光波长范围内。CCD对微弱信号的放大功能不及光电倍增管,因而需要额外的放大系统来将信号放大才能达到光电倍增管的灵敏度范围的上限。其主要的缺点是:CCD探测器的实际数值孔径难以达到06-09的范围,在低亮度背景下,限制微弱信号被检测出来, 另外CCD探测器不能与共聚焦系统相兼容;但是在高亮度背景下, 因为CCD探测器有内置式扫描功能,其优越性就体现出来了。

    所有的微阵列扫描仪都有固定和放置微阵列固相基质的装置,我们称之为扫描仪的载样盒。载样盒要有能够容纳下玻片的空间,组成其的材料应能经受的住上千次取放样品的刮擦考验。通常微阵列的固体介质为显微载玻片,还有塑料片,但是塑料片不如玻璃片刚硬,容易变形,不易聚焦准确,所以多数研究者使用的是显微载玻片。扫描检测时通常是在室温下进行,此时玻片上各点样品已经干燥,然而,有些染料如FITC在潮湿的环境下才能释放出强烈的荧光,所以研究者们在待测样品上滴加适量的缓冲液,然后盖上盖玻片进行观察。这就需要载样盒能够容纳载玻片与盖玻片叠加之后的厚度,扫描仪在扫描时聚焦于盖玻片下的那一层平面进行扫描。

    以下要介绍共聚焦扫描微阵列的工作原理,顾名思义,共聚焦扫描仪将视野中的两个聚焦点的影象装配为二维图象,工作过程如所示:平行的激光束通过光束分离器后进入目镜,目镜采集到部分球状散射的荧光释放光并使这些光成为平行的光束,此外还采集被反射的激光,这些激光的强度要比荧光强度大3-7倍。采集回来的光束再次通过光束分离器,光束分离器将大部分激光反射回激光源处,并允许大部分荧光束通过光束分离器,一面平面镜将荧光束反射到释放光栅处,光栅选择很窄范围波长的光通过,并将剩余的激光激发光全部反射回去。共聚焦的工作特点体现在探测目镜和开了一个针孔大的孔的光线挡板上,探测目镜将平行光聚集为很小直径的一束光之后,挡板上的小孔只允许聚焦的光线通过并将其余的光遮挡住。图5显示若发光点不在目镜焦点范围内,则光线将被探测目镜聚集于挡光板前,散射之后大部分光线被遮挡了,只有焦点范围内的光线才能有效地进入当光板的小孔被探测器检测到。对焦距范围的严格限制使得灰尘或近表面的小颗粒均不能成像被探测到,因而共聚焦扫描仪获得图象的信噪比要高于非共聚焦扫描装置。但另一方面,对焦距范围的严格限制要求载玻片摆放非常平稳,扫描运动过程中载样盒要保持在同一水平面上,偏差要小于焦距的范围,偏差小于±10mm。这一要求增加了机械加工的精密度,使得加工工艺更加复杂,但这是保证获得最佳图象质量的有效途径之一。


         

      图4共聚焦扫描的工作原理              图5目镜焦点范围之外的光线被遮挡


    由于激光共聚焦于载玻片上的一点上,要获得整张玻片上的各点的荧光信息则要对玻片各点进行扫描成像。可通过移动扫描器或移动目镜和载玻片来实现上述功能。扫描器移动后要求目镜能采集到荧光释放光束,这样的目镜很复杂且数值孔径不超过0.3,较为简单的并且采集光效率高的办法是移动目镜或载玻片,但移动的物体大势必影响扫描速度。不过在弱光环境下,图象读取速度取决于探测到的光子的累积量,所以即使扫描速度快而光采集效率低的话图象读取信号也未必快。

    所有的扫描仪都会面临同样的一个问题,即如何将背景降低并提高待测样品的信号。共聚焦技术的应用使得共聚焦扫描仪能比其它类型的扫描仪获得更高质量的图像信号。在共聚焦扫描仪中有光束分离器及释放光栅将荧光信号分离并传输给探测器,而将激发光和杂质产生的光反射回去并阻挡它们到达探测器。探测器是光电倍增管,其灵敏度高,可探测到一个光子的存在,光电倍增管内的功率放大器可将光信号转化为电信号并放大100万倍,通过调整电压输出可改变光电倍增管的灵敏度范围,微阵列上不同样品的制备过程导致对仪器灵敏度要求不同,内置式的可调灵敏度装置恰好可适应这些不同的变换。传统的硅探测器如PIN光电二极管,没有内置放大装置,在可见光范围内灵敏度很低,因而需要外置的功率放大器,这就增加了杂讯,降低了信噪比。硅探测器在800-900nm范围内有一波长应答高峰,因此用它们探测近红外范围的染料较为理想。光电倍增管通常在500nm左右范围内有一波长应答高峰,高于650nm后则灵敏度迅速降低。它们适用于大部分可见光范围的染料。

    微阵列扫描仪灵敏度范围要求:在微阵列样品制备过程中,步骤较多,如PCR反应、杂交反应条件变化多、试剂存储条件不同、不同类型的基因表达等因素的影响,即使适用相同的染料,其亮度也可能相差1000倍,在同一快微阵列上的荧光强度范围可达到4000:1的范围。大部分扫描仪的荧光强度读取范围在4000-16000,若不改变仪器的灵敏度范围,就无法适应各种荧光强度样品的读取。调整仪器灵敏度范围的方法有两种:其一是改变激发光的强度,用激光衰减器可调整改变激发光的强度其可调范围至少为100:1。其二是改变光电倍增管的灵敏度,通过变化输入电压的大小,光电倍增管的灵敏度改变范围至少为100:1。两项调整方式可相互叠加使得仪器的调整范围增加到10000:1,这一范围对普通的扫描仪都足够了。通常人们希望使用的激光强度大而不破坏样品上的荧光分子,我们已经知道,激光强度越大激发的荧光光子越多,信号也越清楚和强烈。但是若样品经过多次扫描后,被破坏的荧光光子将增加,所以要将荧光强度降低以防样品上的荧光淬灭。

    信号转换及采样过程:由被激发的荧光染料产生的光学信号将通过一系列过程转变为数码信号。荧光信号是由一系列随机的光子释放累加而成。若将它们累计可与某一样品区域的染料分子的密度相关。通常扫描仪对空间上和时间上探测到的荧光光子的数量都加以累计并取平均值才能代表某一样品区域的染料分子的密度。被扫描的区域被分为大小相同的像素。激光共聚焦和其它点-照明式扫描仪对逐个像素进行激发,然后探测器累加各像素点上荧光释放分子。将光信号转化为电信号并数值化。各像素的数码分辨率可达到16-比特,当扫描图像正在进行时,显示器要显示图像以供扫描者作初步的分析,扫描过程结束后可将图像保存为图像格式文件如TIFF格式,这种格式的图像文件时目前用途较广的一种图像文件。

    控制和自动化系统是由电脑来完成的。扫描仪使用者无须精通扫描仪的光学和电子学部分,已商品化的扫描仪已经经过大量的测试和信息反馈并不断地改进,使其用户界面越来越友好,图形化的操作界面使得初学者只需接受简单的训练或阅读操作手册就能够使用仪器。控制软件具有许多自动设置功能,为使用者节省时间提高工作效率。如:不同的用户扫描不同样品可设置、保存、再现扫描参数;可自动设定2个以上的扫描激光波长并自动保存图像结果;对某一扫描波段自动调整灵敏度、激发光强度、及探测器探测范围等。

扫描仪各部件功能参数主要如下:
    激光源的数目和荧光波段 第一代微阵列扫描仪通常是两个或四个荧光波段及两个激光光源,而第二代仪器则含三或四个激光光源并可选择10种荧光波段。

    另外,分辨率、灵敏度、扫描速度、扫描视野、扫描图像定位的准确程度等指标也是设计和制造微阵列扫描仪所需考虑的技术指标。微阵列扫描仪之间的比较是一个复杂的过程,不应仅仅对单个性能参数进行比较,通常需要对扫描样品进行综合测试。


ScanArray共聚焦微阵列扫描仪
General Scanning ,Inc.公司已经建立了ScanArray共聚焦微阵列扫描仪的生产线,目前全世界的许多生物技术和遗传基因组分析实验室都在使用该种仪器进行科研工作。
ScanArray的结构组成是:样品载体移动、光源固定、多个激光头的共聚焦扫描仪。数值孔径可达0.75,扫描速度达20线/秒。
ScanArray共聚焦微阵列扫描仪优越性能表现在:操作简单、体积小,数值孔径高、扫描速度快,灵敏度和分辨率高

目前有两种型号:ScanArrayâ3000和ScanArrayâ5000,它们的性能如下:

性能指标 ScanArray3000 ScanArray5000
结构 样品载体移动、光源固定、多个激光头样品载体移动、光源固定、多个激光头
数值孔径0.75 0.75 
载样介质 所有标准的1''´3''显微载玻片 所有标准的1''´3''显微载玻片 
视野不小于22mm´60mm 不小于22mm´60mm 
扫描速度6线/秒 20线/秒
分辨率10;50(预扫描) 5,10,20;30;50(预扫描)
激光束 两种(543nm和633nm) 四种(488nm,514nm,543nm,594nm,612nm,633nm)
释放光波段210
输出格式16-bit 116-bit 1
体积25"长´10.5"宽´11.5"高 30"长´15.5"宽´13.5"高
重量3560-70(取决于激光头的数目)


参考文献:
Ormerod,M.G.(ed.). In Flow cytometry: a practical approach,P, 29. IRL Press.
Tomei, L.D.(1988). US Patent 4758727.
Kain, R. C.(1998). US Patent 5719391.
Kain, R.C., Miller, M.F., and Majlof, L. (1996).US Patent 5578818.

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