如何保证纯化的细菌RNA保持原有的表达模式[新品推荐]

【字体: 时间:2002年02月01日 来源:

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    用传统方法从细菌中分离RNA,有两个主要因素会导致细菌表达模式的改变,影响基因表达分析。一是由于酶降解RNA导致一些转录本的损失甚至丢失,这一点对细菌mRNA的影响尤为严重,因为细菌mRNA的半寿期很短,往往只有几分钟。二是某些基因在操作过程中(裂解前,参见附注)被诱导表达,导致这些基因表达增高。

    Qiagen公司的RNeasy Protect Bacteria Mini and Midi Kits就可以有效解决这个问题。

    首先,在分离RNA前,直接在细菌培养物中加入2倍体积的RNA稳定剂,这种稳定剂对于生长在基本培养基或者丰富培养基的大多数细菌,包括革兰氏阳性菌(如葡萄球菌、分支杆菌)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、沙门氏菌)都同样有效。使用的方法很简单:将RNA稳定剂直接加入刚摇好的细菌培养物中,混匀,可以立即稳定细菌中的RNA免受降解。

    经过这种处理的细菌可以根据需要采取酶裂解或者机械破碎或者混合的方法,进行充分破碎而无需担心RNA降解。

    剩下的步骤就是RNeasy试剂盒提取细菌RNA。RNeasy专利设计的硅胶膜技术和柱式离心技术,无需酚氯仿抽提,也不用进行繁琐的RNA沉淀,简单几个步骤就可以得到高质量的RNA,同时将DNA的污染减到最低。对痕量DNA也很敏感的实验,可以选用RNase-Free DNase Set,在分离RNA的过程中直接在纯化离心柱上消化DNA,最后洗脱得到没有DNA污染的RNA。

    不过值得注意的是RNeasy技术能够富集所有大于200个碱基的RNA,因而纯化得到的RNA产物中不含5S rRNA、tRNA或者其他低分子量RNA。

    我们可以在以下的例子中看看RNAprotect的作用:在生长中的大肠杆菌培养物中加入RNA酶抑制剂利福平rifampicin以终止转录反应,将培养物分成两份,一份加入RNAprotect Bacteria Reagent,分别在0、4、8、16分钟取样提RNA。电泳检测结果并用Northernblot的方法检验结果中两种半寿期不同的RNA的量:ompA(half life 15min) beta lactamase(half life of 2-5min):结果可以看到加入RNAprotect试剂的样品中RNA的表达丰度得到很好的保护,这样的结果才是真实的具有研究价值的细菌表达模式。更详细的资料和价格信息参见生物通商城中Qiagen公司的电子目录。

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