利用Odyssey回收PAGE胶中红外荧光染料标记的DNA片段[创新技巧]

利用Odyssey回收PAGE胶中红外荧光染料标记的DNA片段

一、背景简介：
    扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphisms, AFLP）是一种应用很广泛的技术，如：遗传作图、快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记、AFLP辅助的轮回选择育种、基因表达与调控、分类与进化研究等。

    我们知道，Genomic DNA AFLP主要是对基因组DNA限制性酶切片段的选择性扩增，使用双链人工接头与基因DNA的酶切片段相连接作为扩增反应的模板，接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合点，从而产生大量的不同的AFLP的指纹。这些技术在品种鉴别，目的基因定位及遗传图谱构建中得到了广泛的应用。LI-COR公司针对这类应用，专门开发了相应的试剂盒——Genomic DNA AFLP Kit。而LI-COR公司最新推出的cDNA AFLP试剂盒是应用由AFLP衍生的cDNA-AFLP技术对基因的表达进行研究。它的实验思路和应用领域与差示聚合酶链反应（Differential display polymerase chain reaction, DD-PCR）相类似。DD-PCR技术是由美国哈佛医学院的Peng Liang和Strauss于1992年发展的一种用于分离和克隆哺乳动物异常和正常细胞之间差异表达基因的PCR反应，现在已被广泛应用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。

    而在以上这两项技术中，如果可以对感兴趣的条带进行回收，直接用于测序或是Northern Blot，这种改进可大大节约时间、实验费用和劳力。



二、LI-COR用于AFLP的完整的解决方案：
    目前，LI-COR Biosciences公司最新推出了用于cDNA AFLP的试剂盒，进一步补充了LI-COR在AFLP研究领域完整的解决方案。并且，最新的，同样使用红外技术的仪器Odyssey，可以使使用者首次可以从测序的结果中，将自己感兴趣的条带提取出来，以做进一步的分析。现在，LI-COR公司已经可以提供以下一套完整的系列产品，用于AFLP的研究工作：

1． 试剂：包含有Genomic DNA AFLP和cDNA AFLP两种。

2． 硬件：LI-COR NEN Global IR2 DNA分析系统具有多种不同的型号，可满足不同的通量需求，它最多可进行96道上样，每块胶可以上样两次，并且可以同时使用两种染料（IRDye700™ 和IRDye800™，波长相差100nm左右，无频谱覆盖），它还可以得到类似于放射形自显影的胶的真实图象，为实验分析提供了可靠的依据与便捷的方法。

3． 软件：可以使用LI-COR公司专门为AFLP研究所开发的SagaMX软件，是目前自动化程度最高的AFLP软件；也可以选择使用KeyGene公司所开发的AFLP Quantar PorTM软件进行结果分析。

4． AFLP条带提取：使用同样基于近红外染料技术的Odyssey^TM Infrared Imaging System可将AFLP结果中感兴趣的条带进行定位，然后可以提取出来，用做测序或是Northern Blot等进一步研究，这是目前唯一可对条带提取的系统，大大节省了工作时间。

　

三、使用Odyssey进行条带回收方法介绍：
    以下是使用OdysseyTM Infrared Imaging System回收所需要条带的方法的简单介绍：
    首先，为了使条带信号强度增强，可使用32孔的测序用梳子，或是将64孔的纸梳子，每隔1或2个齿去除1或2个齿，以增加上样样品的反应量。

    LI-COR推荐使用25cm长，8%浓度的测序胶，因为在这个条件下，条带可以较好地分离，而且邻近条带不会相互交叠。

    在LI-COR DNA分析仪上使用1500V、40W、40mA、45℃的电泳条件和第4档扫描速度。在上样前，是样品孔完全平整。

    预电泳，准备结束后，上样。进行电泳，并通过LI-COR测序仪的Global Controller中的软件对进程进行监控。你可以在电脑屏幕上看到你希望回收的条带经过激光器。当它到达底部时，关闭DNA分析仪。

    将测序胶板从DNA分析仪上取下。擦干测序胶板，使用蓝色或红色（因为其波长在700nm和800nm左右，可以被Odyssey所扫描检测到）的记号笔在测序胶板上画上网格。竖直的格线用于区分不同的泳道，而水平的格线用于确定所希望回收的条带在泳道中迁移到的位置。也可以使用有网格的透明膜，但要使条带与电泳泳道相符合，并且要将其粘在测序胶板上，以免在扫描的过程中发生移动。

    翻转测序胶板，使短板朝上。楔开上层板，并将其缓慢移开。测序胶即被黏附于两块测序胶板之一上。移开测序胶上的Spacer，并将它放置在胶上，最好放置在没有样品的地方。将两块测序胶板整齐地叠放在一起，而使附着有Spacer的测序胶朝下放置在Odyssey上进行扫描。因为Spacer的存在，可以使测序胶与Odyssey的扫描表面之间有0.25mm的间距，避免了直接的接触。
　

在Odyssey上扫描时采用如下参数：
Resolution = 169μm；
Quality = medium;
Focus Offset = 0.3mm;
Intensity = 4-5。

    通过Odyssey扫描所得到的图象，可以使得使用者确定所希望回收的条带在胶上的位置，并通过解剖刀或是剃刀刀片将所希望得到的条带取下来，放置在Eppendorf 管中，用做接下的DNA的回收等工作。