知道更多,用得更好——关于经典高保真Pfu DNA聚合酶的几个问题[心得点评]

【字体: 时间:2004年05月25日 来源:

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    Stratagene公司的Pfu是当今世界公认最好的高保真PCR酶,为了达到更好的实验结果,在实验前不妨了解一下这个酶——知道更多,用得更好。

Q1. 克隆型和天然型 Pfu DNA聚合酶有什么不同?
天然型Pfu 直接从热稳定性细菌Pyrococcus furiosus 纯化而来;克隆型Pfu 是从大肠杆菌中纯化得到的重组型产品。天然型和克隆型的Pfu 的PCR扩增基本特性和保真性基本一致,但是我们发现克隆型Pfu 的弥散背景与天然型相比更低。另外,Stratagene独有的专利Archaemaxx因子(与天然型Pfu共纯化得到)可以略微改善Pfu的操作性。

Q2. Pfu有什么扩增特点,最优化的延伸温度是多少?
天然型和克隆型Pfu DNA聚合酶的延伸速度均为72℃,2 min/kb。PfuTurbo DNA聚合酶扩增小片段时,延伸速度为1 min/kb,长片段(如6-10 kb的基因组模板或10-15 kb的质粒DNA模板)则要求2 min/kb。

Q3. 常见的一些PCR添加剂能和Pfu DNA聚合酶一起使用吗?
说明书中提到DMSO,甘油,甲酰胺,硫酸铵,Perfect Match和BSA都是可以使用的添加剂。但是保真性是否受影响却不一定。使用这些添加剂主要是提高酶的活性。

  • DMSO:改善GC含量高的DNA的变性情况,使聚合酶更容易在二级结构区延伸,但是当浓度大于10%时会降低保真性。

  • 甘油:提高产量,增加酶的稳定性。

  • 甲酰胺:促进某些引物-模板退火,降低带有二级结构的DNA的变性温度。

  • 硫酸铵:增加反应体系的离子强度,改变DNA的变性及退火温度,调节酶活。 

  • Perfect Match:通过降低错配引物-模板的稳定性而提高PCR产物特异性;帮助去除二级结构使延伸进行得更顺利。 

Q4. Pfu DNA聚合酶的错配率是多少?
PfuUltra和PfuTurbo是目前市场上高保真最高的热稳定聚合酶,以每轮复制中出现的碱基突变检测,其错配率分别仅为4.3x10-7和1.3x10-6

Q5. 如何用Pfu DNA聚合酶扩增的产物进行TA克隆?
制备用于TA克隆的带有A尾巴的PCR产物最好选用Easy-A高保真PCR克隆酶。这个酶同时具有Pfu 的高保真性和末端转移酶活性。Pfu 的扩增产物也可以用于TA克隆,但是需要增加一步加尾反应以使产物带上A尾巴。具体做法是:取1-7µl纯化的PCR产物加上1 µl 10X Taq DNA聚合酶缓冲液(含有MgCl2),终浓度为0.2 mM的dATP,5u Taq DNA聚合酶,加蒸馏水至10 µl,70℃反应15-30min。取1-2 µl进行连接反应。不过,我们推荐直接用Easy-A做TA克隆。

Q6. Pfu DNA聚合酶95℃下稳定性如何?
Pfu DNA聚合酶95℃下1小时仍能保持95%的活性。

Q7. Pfu DNA聚合酶和Pfu Turbo之间有什么不同?
PfuTurbo是克隆型Pfu DNA聚合酶的改进产品,添加了一个特殊的聚合酶增强因子,Archaemaxx。在PCR进行过程中,由于dCTP自发去氨基造成dUTP累积,进而导致Pfu 结合在模板上,PCR被阻滞。Archaemaxx是一种dUTPase,能将dUTP转为dUMP,使聚合速度加快达到1 min/kb (但6-19 kb的基因组模板和10-15 kb的质粒模板还是要2 min/kb)。PfuTurbo 的扩增能力有所提高还表现为能用于扩增更长的模板。从保真性来讲,Pfu和PfuTurbo 水平一致。 

Q8. Pfu DNA聚合酶能扩增多大的片段?
克隆型和天然型Pfu DNA聚合酶扩增质粒模板可达10kb,基因组模板上限为6kb。PfuTurbo扩增质粒模板达15kb,而且已经扩增出长达19kb的基因组DNA。PfuUltra也成功地扩增了17kb的基因组模板。

Q9. Pfu Turbo 和 Pfu Ultra的主要区别是什么?
主要差别是保真性不同。PfuUltra 比PfuTurbo保真性高3倍以上。两者的PCR反应参数基本一样。

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