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20年回顾:Lambda文库构建技术的革新与贡献[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2004年05月26日 来源:

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    上世纪80年代,Lambda文库构建系统成为最流行的发现新基因的途径。其中的关键主要在于这套系统包装克隆的效率要远远高于其它技术。然而,在Lambda文库构建技术真正流行之前,存在两大障碍——包装提取物效率低,以及Lambda模板不适合作为测序和诱变等后续操作,是Stratagene公司的科学家们的卓越创新,以GigaPack系列包装提取物和Lambda ZAP载体系统及其预制文库产品使这些问题迎刃而解。

从cDNA文库中发现低拷贝的新基因要求尽量构建具有最佳代表性的cDNA文库

突破109 包装效率的上限

    从cDNA文库中发现新基因的主要挑战来自于该基因的转录产物往往是低拷贝的,很是稀少,这就使尽可能构建一个具有最佳代表性的cDNA文库成为重中之重。Gigapack® 是商业化的包装抽提物中最先打破包装效率1 x 109 pfu/ug上限的产品。拥有了包装效率这么高的包装提取物,对所有想构建代表性好的科学家来说真是幸事,发现稀有转录产物的研究变得容易多了(图 1)。

    去除包装提取物中的限制性酶系统是提高效率的关键因素。以前的lambda包装提取物产品通常带有限制性酶系统,会切割外源DNA,对DNA克隆有显著的负作用。Stratagene的科学家通过去除绝大部分引起麻烦的酶,开发了著名的Gigapack家族系列抽提物,帮助研究者能够轻而易举地获得极高的包装效率。岁月流逝,Stratagene完善Gigapack的步伐并未停止,更多的酶被从抽提物中去除,而该系列中一些特别的Gigapack品种甚至可以用来包装非常大的片段,包装长达47— 51 kb的重组子已不是天方夜谭了。

 

不能用于测序、定点突变和其它许多克隆完成后经常要用到的一些操作,极大地限制了lambda文库的应用

 

体内切割技术(In Vivo Excision)的革命

    Stratagene在文库构建方面的贡献远不止大幅度提高包装效率这一个技术环节,其开创性的工作还体现在改进lambda载体,使它更方便用于下游应用。众所周知,尽管lambda载体在包装效率方面是极为突出的,但由于lambda DNA难以用于测序、定点突变和其它许多克隆完成后经常要用到的一些操作,极大地限制了lambda文库的应用。而质粒文库非常适合上述这些下游操作。所以,研究者不得不将插入片段亚克隆到质粒载体上,甚至放弃lambda的高性能而直接建质粒文库。而Lambda ZAP® 载体系统则不需要亚克隆步骤,可以轻松完成pBluescript® 噬粒的切割。测序,蓝白斑筛选以及用pBluescript在大肠杆菌中表达蛋白因此也变得非常方便了。这种切除(excision)不仅很容易进行,而且可以高通量操作。只需一步,lambda文库就变成质粒文库啦(图2)。 

Lambda的今天和明天

    cDNA克隆在分离克隆和发现新基因的研究中是极其重要的手段。在科学家们完成了人、小鼠等全序列测定后,大量新基因得以发现。然而,研究者要从其它(未测全序列的)生物体发现新基因时,lambda文库仍然是非常有价值的工具之一。Gigapack包装抽提物和Lambda ZAP载体将继续以其最好的质量,最富有创新价值的一贯表现,为更多的研究者构建极佳代表性的lambda文库提供帮助。


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