PfuUltra高保真DNA 聚合酶好在哪里？

【字体：大中小】 时间：2004年08月06日 来源：

编辑推荐：

四大王牌：

保真度最高的DNA聚合酶，比普通Pfu保真性提高3倍以上
带有ArchaeMaxx™聚合酶增强因子，扩增性能更出众
扩增效率高，最适合PCR克隆，RT-PCR以及定点突变等要求较高的实验应用
提供热启动版，提高扩增专一性，减少产物背景

保真度最高
Stratagene的Pfu酶一向都是研究人员心目中最好的高保真酶，如今，Stratagene新推出的PfuUltra以由Pfu DNA聚合酶经基因工程改造而来，具有更佳的校验活力。数据显示PfuUltra™高保真DNA聚合酶的平均错配率为Pfu DNA聚合酶的三分之一，为Taq DNA聚合酶的十八分之一。是目前保真度最高的PCR酶。

市场上保真度最高的PCR酶
PfuUltra™高保真DNA聚合酶是目前市场上保真度最高的PCR用DNA聚合酶。（保真度＝1/错误率）
数据来源：美国冷泉港实验室

添加ArchaeMaxx™聚合酶增强因子，显著提高产量、减少扩增时间并可扩增更长的模板。

高保真酶的弱点在于有校验活力而导致产量偏低——扩增同样的次数可是产物少，正所谓慢工出细活儿。真正背后的原因还有在PCR过程中由于dCTP脱氨基生成dUTP，dUTP的累积会造成所谓"PCR poisoning"，抑制PCR反应，也阻碍Pfu的校正功能，从而某种程度上限制了酶的精确度和延伸模版的能力。PfuUltra特别添加ArchaeMaxx™聚合酶增强因子，能将dUTP分解为无毒的dUMP和焦磷酸，从而解除dUTP累积造成的影响——不要小看这一点改进，它可以显著提高产量、减少扩增时间并可扩增更长的模板。

PfuUltra™高保真DNA聚合酶可扩增长达17kb 的基因组模板

更高的扩增效率

除了添加ArchaeMaxx™聚合酶增强因子，PfuUltra本身有更为出色的扩增效率。扩增效率通常指每个PCR循环可以扩增的倍数。一但一个PCR系统的扩增效率确定，可以用来计算给定量模版所需要扩增倍数，或者需要达到某个产量时需要扩增的循环次数。由于PCR过程是一个指数扩增的过程，扩增效率一点点提高，经过指数放大就得到惊人的结果——比如一个25循环的PCR反应体系，扩增效率提高5%，得到的产物是原来的两倍！扩增效率低会导致产物少，需要更长的反应时间和循环次数，也就增加出错的几率和非特异的产物的几率。实时定量PCR结果证明：PfuUltra的扩增效率比现有的任何一个带校验功能的高保真酶都要高。

PfuUltra ™ 热启动型 DNA 聚合酶
普通的PCR扩增酶在室温下与模版和引物混合后即可高效开始扩增，由于模版可能存在二级结构、引物的非特异结合会导致PCR过程中出现讨厌的背景——例如俗称鬼带的附产物。此外高保真酶由于带有校验功能，就是3’到5’的外切活力，还有可能会在引物还没有和模版结合前降解部分引物，导致引物特异性降低。基于抗体的热启动型PfuUltra，在常温下抗体中和酶活力，直到扩增循环开始抗体失活才将酶释放出来，可有效解决了背景的问题。操作流程与基本PfuUltra一致。

模板长度	0-17 kb (基因组)0-15 kb (载体)
延伸时间	1 min/kb (0-6kb)2 min/kb (>6kb)
平末端或3’-A末端	平末端
保真性 vs. Taq	18X
是否添加ArchaeMaxx™ 因子	是
是否提供热启动型	是
是否提供反应混合物	是

标准反应体系 (请注意按顺序加入)

反应组分	体积
蒸馏水	40.6ul
10×PfuUltra HF专用反应缓冲液	5.0ul
dNTPs (每种25mM)	0.4ul
DNA模板（100ng/ul）50－100ng基因组DNA100pg－100ng Lambda或质粒DNA	1.0ul
#1引物（100ng/ul）浓度0.2－0.5mM通常18-25寡核苷酸为100－250ng	1.0ul
#2引物（100ng/ul）浓度0.2－0.5mM通常18-25寡核苷酸为100－250ng	1.0ul
PfuUltra HF热启动酶（2.5U/ul）2.5U：质粒模板可达15kb基因组模板可达10kb<孤> 5.0U：质粒模板可达10kb以上基因组模板可达17kb以上	1.0ul (2.5U)
反应体系总体积	50.0ul

单槽式PCR仪反应标准程序

循环数	温度	持续时间
1	95℃	2 min
30	95℃	30 s
	引物Tm－5℃	30 s
	72℃	1 min (模板<1kb) 1 min/ kb （模板>1 kb)
1	72℃	10min

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知道更多，用得更好——关于经典高保真 Pfu DNA 聚合酶的几个问题

1. 克隆型和天然型 Pfu DNA聚合酶有什么不同？
天然型Pfu 直接从热稳定性细菌Pyrococcus furiosus 纯化而来；克隆型Pfu 是从大肠杆菌中纯化得到的重组型产品。天然型和克隆型的Pfu 的PCR扩增基本特性和保真性基本一致，但是我们发现克隆型Pfu 的弥散背景与天然型相比更低。另外，Stratagene独有的专利Archaemaxx因子（与天然型Pfu共纯化得到）可以略微改善Pfu的操作性。

2. Pfu有什么扩增特点，最优化的延伸温度是多少？
天然型和克隆型Pfu DNA聚合酶的延伸速度均为72℃，2 min/kb。PfuTurbo DNA聚合酶扩增小片段时，延伸速度为1 min/kb，长片段（如6-10 kb的基因组模板或10-15 kb的质粒DNA模板）则要求2 min/kb。

3. 常见的一些PCR添加剂能和Pfu DNA聚合酶一起使用吗？
说明书中提到DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸铵，Perfect Match和BSA都是可以使用的添加剂。但是保真性是否受影响却不一定。使用这些添加剂主要是提高酶的活性。
· DMSO：改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构区延伸，但是当浓度大于10%时会降低保真性。
· 甘油：提高产量，增加酶的稳定性。
· 甲酰胺：促进某些引物－模板退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。
· 硫酸铵：增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。
· Perfect Match：通过降低错配引物－模板的稳定性而提高PCR产物特异性；帮助去除二级结构使延伸进行得更顺利。

4. Pfu DNA聚合酶的错配率是多少？
PfuUltra和PfuTurbo 是目前市场上高保真最高的热稳定聚合酶，以每轮复制中出现的碱基突变检测，其错配率分别仅为4.3 x 10^-7和1.3 x 10^-6。

5. 如何用Pfu DNA聚合酶扩增的产物进行TA克隆？
制备用于TA克隆的带有A尾巴的PCR产物最好选用Easy-A高保真PCR克隆酶。这个酶同时具有Pfu 的高保真性和末端转移酶活性。Pfu 的扩增产物也可以用于TA克隆，但是需要增加一步加尾反应以使产物带上A尾巴。具体做法是：取1-7μl纯化的PCR产物加上1 μl 10X Taq DNA聚合酶缓冲液（含有MgCl2），终浓度为0.2 mM的dATP，5u Taq DNA聚合酶，加蒸馏水至10 μl，70℃反应15-30min。取1-2 μl进行连接反应。不过，我们推荐直接用Easy-A做TA克隆。

6. Pfu DNA聚合酶95℃下稳定性如何？
Pfu DNA聚合酶95℃下1小时仍能保持95％的活性。

7. Pfu DNA聚合酶和Pfu Turbo之间有什么不同？
PfuTurbo是克隆型Pfu DNA聚合酶的改进产品，添加了一个特殊的聚合酶增强因子，Archaemaxx。在PCR进行过程中，由于dCTP自发去氨基造成dUTP累积，进而导致Pfu 结合在模板上，PCR被阻滞。Archaemaxx是一种dUTPase，能将dUTP转为dUMP，使聚合速度加快达到1 min/kb （但6-19 kb的基因组模板和10-15 kb的质粒模板还是要2 min/kb）。PfuTurbo 的扩增能力有所提高还表现为能用于扩增更长的模板。从保真性来讲，Pfu和PfuTurbo 水平一致。

8. Pfu DNA聚合酶能扩增多大的片段？
克隆型和天然型Pfu DNA聚合酶扩增质粒模板可达10kb，基因组模板上限为6kb。PfuTurbo扩增质粒模板达15kb，而且已经扩增出长达19kb的基因组DNA。PfuUltra也成功地扩增了17kb的基因组模板。

9. Pfu Turbo 和 Pfu Ultra的主要区别是什么？
主要差别是保真性不同。PfuUltra 比PfuTurbo保真性高3倍以上。两者的PCR反应参数基本一样。