细胞因子检测技术异军突起：ELISPOT[创新技巧]

 开宗明义

     在免疫学领域中,对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答,细胞介导的免疫应答(cell mediated immune response , CMI)也是人们所关注的,而T细胞在CMI中起关键作用。在研究细胞免疫应答保护作用及其机理方面,有多种研究方法可以使用，如：ELISA（酶标记免疫附测定法，enzyme-linked immunosorbent assay）、流式细胞分析术（flow cytometry）、定量RT-PCR以及这里要介绍的近年使用越来越多的ELISPOT。作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) ,是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法敏感性高,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中。下面将从原理、具体实验操作、技术优势和应用几方面进行介绍。

原理     ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样的，理解起来并不难，关于ELISA的工作原理可看酶联免疫吸附实验（ELISA）【1】。传统的ELISA与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理,通过酶的高催化频率,放大反应效果,从而达到很高敏感度的检测效果。 如图所示，反应步骤可大致分为： 利用特定细胞因子的单克隆抗体 包被96孔板，封闭剩余的空白位点 加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞，产生细胞因子，细胞因子会往附近扩散与之前包被的抗体进行特异结合 洗掉细胞 加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底物的显色反应，一个细胞所在位置就会显出斑点，最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就可以计算出样品中被激活细胞的数目     以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌特异抗体的细胞只需把包被特异抗体变为包被特异抗原即可。

具体实验操作

    从原理上看ELISPOT的确很简单，但是在操作过程中有许多条件需要摸索，所以这里进一步介绍一下ELISPOT的操作步骤。

1. 将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上,用胶带封板并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗6遍,再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭,室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA的不同之处。理论上是可以同时包被两个不同的抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。
   

2. 将阴性对照和细胞样品,如外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) ,经纯化的CD8⁺T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC,用含10%FCS的培养基稀释至5×10⁴～2×10⁵个/孔如果条件可以达到更高的细胞数，建议可以尝试3×10⁵～5×10⁵个/孔，特别是在分泌细胞）,分装于ELISPOT板孔中,再加入特异的刺激物,如多肽或基因表达产物,提取的抗原等,阴性对照孔中只加入培养基（实验中最好采用无血清的培养基，这样可以避免因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也避免血清的某些成份会引起非特异的反应）,阳性对照孔加入植物血凝素(PHA,2μg/mL)或阳性多肽,37℃,体积比为5% CO²培养24～48h。要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。利用ELISPOT的检测是十分灵敏的，频率低至10^-12的分泌细胞都可以被检测出来。并且对于那些会贴壁的细胞也可以使用此种方法，虽然细胞生长贴壁后不易被洗去，但是不会妨碍最后斑点的显色。只要细胞可以正常分泌与抗体特异结合的产物，这些产物会逐步扩散到细胞四周，最后还是可以显示出斑点。
   

3. 用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次,以弃去细胞,加入生物素化抗细胞因子的检测抗体,孵育3h。再洗6次后,加入AP或HRP标记的链亲和素,室温孵育3h。
   

4. 用PBS-Tween-20 再洗5次,加入底物 室温下显色,待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时,即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数,并用斑点形成单位(sfu/L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原,则可用于ASC测定,这时,每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。

    完成了以上步骤后其实只是完成了实验的一半。在你不断摸索反应的条件之后，得到了一块布满斑点的板，接下来要如何对这些斑点进行分析呢。如果利用显微镜人工技术无疑是太参有个人因素的实验了，实验结果肯定会被审稿人好好质疑一番。随后，有人使用数码相机拍摄下来后，使用photoshop进行处理、计数，这种方法也存在较多的个人因素。一项技术要普及，为广大研究人员所接受，就必需尽量减小人为的误差。所以，近年许多公司开始开发计算机辅助系统，使用系统设定的阈值对斑点进行人工智能计数。这样，由计算机将阴性对照中非特异反应斑点进行去除，同时由计算机进行统一计数，这样的实验结果置信度便大大提升了。目前判断的首要标准还是斑点的大小，但是做过电泳、同位素等的计算机成像的研究人员都遇到过一个问题：很多时候实验会产生一些较淡的斑点，用肉眼判断绝对是背景。所以在设计软件时也必需考虑到斑点深浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进行分析，这项技术的成熟相信会使ELISPOT的应用范围更加扩宽。

A 一个典型的ELISPOT结果的可视化 B 可以将此类结果转化成为数据格式输出

技术优势：

    ELISPOT的历史可以追溯到1963年Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。随着单克隆抗体技术的成熟,1983年,Czerkinsky等采用此法检测脾细胞中分泌特异性抗体的细胞数,发现该方法敏感性高简便易行。后来,他们又用这种方法定量分析受到有丝分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的细胞数。随后,用ELISPOT法在单细胞水平检测分泌其他细胞因子(如IL-2 , IL-4 , IL-5 , IL-10 , TNFα和IL-6) 数量的手段也被建立起来。Nordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性,Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assisted video image analysis ,CVIA) 自动分析TNF2α酶联免疫斑点的大小和数量,计算与负载抗原肽的靶细胞接触后外周血单核细胞(PBMC) 中抗原特异性CD8⁺T细胞的数量,不但提高了对背景染色的分辨力也使大规模研究成为可能。Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来,开发出类似的斑点计数系统,认为当每孔斑点数大于100时,这种方法更客观、可重复性高且节省时间。

    随着ELISPOT技术的不断发展，它的优势也渐渐显示出来，下面将列举ELISPOT对比其它一些传统技术的优势所在。

与ELISA

    ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系统对斑点进行计数， 1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）    由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

与有限稀释法（limiting dilution analysis , LDA）

    LDA能够对特异性CTL细胞进行定量,曾在很多年中被认为是CTL 检测的“金标准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性T淋巴细胞(memorial CTL, mCTL) 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激, 这会加快效应CTL(eCTL)凋亡,且不能定量测定eCTL细胞数量或测定值偏低。其次,该方法较繁琐,培养时间可长达2～3周，而且很容易造成T细胞数量损失。

与四聚体法（Tetramer）

    最近几年出现了MHC2Ⅰ类分子抗原肽四聚体法。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强,即使当体内mCTL水平低于1%,用MHC2Ⅰ抗原肽四聚体法仍可直接测到准确的值,比LDA 敏感度要高5～10倍。但该技术也存在较多应用上的困难：除了合成及稳定MHCⅠ类分子的技术困难外,最主要缺点是表位的选择。由于每次反应只能分析单一的抗原表位,而MHCⅠ类分子结合的各种表位,能否形成CTL反应,却随着基因背景及时间的变化而变化,因此选择正确的表位就显得尤为重要。优势表位的筛选可以通过Elispot 来进行,但对整个肽库进行扫描,并不是一件很容易的事。当然,生物信息学的运用对表位的筛选有很大的帮助。同时,有研究结果表明,并非所有经过Tetramer 鉴定的阳性细胞都有确切的功能, Tetramer阳性的细胞数是用ELISPOT分析能分泌INF2γ细胞数的10倍,其中很多是不表现功能的惰性细胞,可能代表了记忆型CTL前体细胞。Tetramer分析只增加了分析的灵敏度,同时测定其功能很重要。

与Cr⁵¹释放法

    此法是一种比较经典的方法，虽然在检测CTL识别的抗原多样性方面非常有效,且能精确阐明被CTL识别的最佳表位,但至多为半定量的层面,而且Cr⁵¹标记细胞的自发释放率较高,不适于较长时间培养；标记时所需的细胞浓度较高,因而给试验带来诸多不便；此外,Cr⁵¹释放法所测定的是一个细胞群体的特性,而不是单个细胞。

与胞内CK染色法

    与ELISPOT法相比较,胞内CK染色法(intra-cellular CK staining,ICS) 主要应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的FACS法,是检测循环淋巴细胞中抗原特异性T 淋巴细胞的可行方法,而ELISPOT法却可以检测所有分泌CK的eCTL 。

应用

    目前，ELISPOT已被用于检测药物、化学制剂及其它CK复合物的特性及功能等方面,因此为体内免疫功能的调节效应提供了检测依据。近几年来, ELISPOT技术在肿瘤疫苗评价试验、免疫监测及免疫学研究中越来越被广泛地使用。

在抗肿瘤免疫及相关领域中的应用

    在许多研究中,该技术已被用于免疫动物外周血淋巴细胞中抗原特异的细胞毒性T细胞(CTL)的数量检测。近期,ELISPOT技术已用于分析和评价从传染病病人的PBMC中检测肽特异的T淋巴细胞以及在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞的疫苗试验。

    ELISPOT检测T细胞反应时敏感性、特异性和可重复性都很高,操作简单迅速,需要少量标本,在检测抗原特异性细胞数量的同时也反应其功能,并与临床结果相关。ELISPOT平板可以提前大量准备,移液、洗板和读板都可自动化,因而大批量检查也可做到快速高效。在与与其他方法的比较后,ELISPOT很可能成为定量分析肿瘤或病毒特异性的T细胞反应的首选。

在抗感染免疫中的应用

   CTL在抗病毒感染的免疫应答中占有主要地位,而CD4⁺辅助性T细胞亚群Th1/Th2的平衡在抵御病毒感染中起着同样重要的作用。在HIV研究方面,由MHC-1类分子加工的不同抗原经CTL识别并产生免疫应答在控制HIV-1感染中同样起重要作用。利用ELISPOT方法检测CK如IFN2γ就可以进一步了解到针对HIV特异的CTL应答及相关免疫信息。

    此外,ELISPOT法还用于评价由HIV-1感染引起粘膜的CD4⁺T细胞免疫应答以及HIVgp 120g与霍乱毒素共表达的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中,ELISPOT还用来检测通过直肠免疫低剂量甲肝疫苗而产生的细胞免疫应答。在急性的自限性肝炎中,以Th1为主的应答促进细胞介导的免疫,且在控制病毒感染及延缓慢性疾病的发展方面有重要作用。

    在许多抗细菌免疫研究中,该方法也发挥了重要作用。例如：应用ELISPOT试验证实表达大肠杆菌MalE蛋白的重组卡介苗(rBCG.MalE)诱导的T细胞应答是CD4⁺T细胞依赖的,rBCG.MalE 诱导的特异CD4⁺T细胞应答存在Th1/Th2平衡转换现象,并逐步形成Th1/ Th2 混合应答。

临床应用

    目前，已经实现临床检验的领域是对肺结核（TB）的检测。而最近的研究热点就是对于移植的预测。受体对供体特异性HLA抗体一直以来都是器官移植的一大障碍,因为它们的存在不仅介导超急性排斥反应而且还可导致急性排斥反应。因此,HLA抗体的存在限制了异体抗原敏感患者对供体器官的需要,因而增加了等待移植的时间。在心脏,肝脏和肾脏异体移植后早期出现的并发症如急性排斥反应与移植前存在的异体免疫临床相关性迫切需要一种恰当的检测方法在器官移植前能了解受体对供体特异性体液免疫的功能状态。

    在接受移植的人群中，部分因有多次输血、或既往有异体移植失败或多次妊娠史体内曾经存在阳性异体抗体,在他们接受异体移植时,现有的检测方法只能显示他们对异体的免疫功能正常。但他们体内存在记忆B淋巴细胞,一旦受到相应HLA 抗原的刺激则会唤起免疫反应,这不仅影响着移植的结果,甚至会出现危及患者生命的、与移植相关的并发症。

    ELISPOT是一种强有效的检测单个抗体分泌细胞的方法,具有很高的敏感性。因此,刺激记忆B淋巴细胞增殖、分化成浆细胞,并建立一种特异性ELISPOT方法检测HLA抗体产生细胞是最佳手段。 如果ELISPOT要进一步推广应用，特别是临床应用，其标准化将是一个十分重要的问题。美国FDA和NIH等已经开始建立ELISPOT的标准化流程，相信随着ELISPOT技术的成熟、标准化程序的建立，它的应用将更加广泛（生物通作者 朱方雨）。